יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים
18 ביולי 2008
וידאו זה מדגים כיצד להשתמש C. elegans להעריך ניוון מוחיים נוירון דופאמין כמודל למחלת פרקינסון. יתר על כן, מסכי גנטית משמשות כדי לזהות גורמים או לשפר ניוון או neuroprotective.
במעבדת קולדוול (Caldwell Lab), המכונה גם "בקתת התולעים" (Worm Shack), אנו חוקרים מנגנונים של מחלות נוירולוגיות ב-Caenorhabditis elegans. ולאחר יום ארוך של ניסויים פוריים, אנו מתגמלים את עצמנו בפעילות פנאי. שלום, אני אדם נייט, סטודנט לתואר ראשון ממעבדת קולדוול במחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת אלבמה.
היום, אני ואחרים נראה כיצד לבצע בדיקה של דגנרציה של נוירוני דופמין ב-C. elegans. אני אבצע הכלאה בין זן תולעים עם דגנרציה נוירונית של דופמין לבין זנים טרנסגניים המבטאים באופן יתר גנים מועמדים הקשורים למחלה ונוירוני דופמין. שלום, אני אדם הרינגטון, סטודנט לתואר שני במעבדת קולדוול.
היום אראה לכם כיצד להכין תולעים טרנסגניות לניתוח נוירוני דופמין. שלום, אני Shu Amichi ואני סטודנט לתואר שני. כאן אראה לכם כיצד לבצע בדיקה לנוירוני דופמין של C elegans, הנקראים CEPs ו-ALAs.
בדרך כלל, תולעים המבטאות GFP בלבד בנוירוני דופמין אינן מראות מוות של תאים. עם זאת, בנוכחות CLE, תבחינו בתהליכים אלו ובניוורו-דגנרציה התלויה בגיל. באמצעות בדיקה זו, ניתן לבטא במקביל טרנסגן בנוירוני הדופמין כדי לקבוע האם הוא יכול להגביר או לדכא את הרעילות המושרה על ידי CLE. אז בואו נתחיל.
לפני ביצוע ניתוח נוירוני הדופמין, עלינו תחילה להכריז את זני ה-GaN המתאימים כדי להניח שמונה תולעים המבטאות הן את alphas nucle והן GFP תחת בקרת הפרומוטור הספציפי לנוירוני דופמין dat one על פלטת הזיווג. כעת הוסיפו שתי תולעי ca טרנסגניות בשלב L4, המראות ביטוי ספציפי לנוירוני דופמין של הגן המועמד הנבחר, וכן ביטוי של הסמן הסלקטיבי הפלואורסצנטי DS red two בתאי שרירי דופן הגוף. חשוב לציין כי עבור כל מבנה טרנסגני אנו מייצרים שלושה קווי טרנסגנים יציבים.
따라서 הצלבה גנטית זו צריכה להתבצע באופן נפרד עבור כל אחד משלושת השבטים היציבים שנוצרו. לאחר יומיים, יש להוציא ולהסיר את הזכרים לאחר יומיים עד שלושה ימים נוספים. יש לבחון את דור ה-F1.
נוצרו מספר צאצאים זכרים וההכלאה הצליחה. בשלב הבא, העבירו באופן פרטני למצעים חדשים חמישה בעלי שלב L4 מההכלאה Aphrodite L וארבעה בעלי שלב L4 מכל הכלאה אחרת, אשר מראים הן את סמן הפלואורסצנציה GFP שהורש מההורה הזכר והן את סמן הפלואורסצנציה DS red two של שרירי דופן הגוף שהורש מההורה hamadi. על בעלי החיים המועברים להיות בשלב L4 כדי להבטיח שהם טרם הגיעו לשלב הבגרות המינית (M).
כאשר הזכרים נמצאים על הצלחת, אפשרו לבעלי החיים להפרות עצמית במשך שלושה עד ארבעה ימים כדי להפיק צאצאים מדור F2. כעת נקה את צאצאי F2; כדי לעשות זאת, העבירו חמישה עד 10 בעלי חיים המציגים את שני סמני ה-cent לצלחות אישיות נפרדות.
לאחר מכן, סרקו את דור ה-F3 כדי למצוא צלחות שבהן מאה אחוזים מהבעלי החיים מביעים GFP בנוירוני הדופמין, וחלק מהבעלי החיים מביעים את הסמן הפלואורסצנטי DS red two בתאי שרירי דופן הגוף. בעלי חיים אלו יהיו הומוזיגוטים עבור הגנים של alpha synuclein ו-GFP, וכן יעבירו באופן יציב את התראנסגן שנוצר זה עתה. עם השלמת הסריקה, נהיה מוכנים לביצוע ניתוח הנוירונים הדופמינרגים.
כדי להתחיל בניתוח הנוירונים, הכינו מצע טרי עבור שלושת בעלי החיים שזוהו בשלב הקודם. הכינו מצע עבור כל אחד משלושת הקווים הטרנסגניים. בנוסף, הכינו מצע עבור זן ה-alpha-synuclein GFP לבדו כביקורת, ואפשרו לתולעים לגדול עד לשלב הבגרות.
לאחר שהתולעים הגיעו לבגרות, העבירו 30 עד 40 בעלי חיים טרנסגניים מכל קו לצלחת חדשה. אפשרו להם להטיל ביצים במשך חמש שעות בטמפרטורה של 20 °C. לאחר חמש שעות, הסירו אותם והשליכם.
מאפשרים לעוברי המבוגרים להתפתח במשך שלושה עד ארבעה ימים ב-20 °C עד שהם מגיעים לשלב L4. לאחר מכן, מעבירים כ-מאה בעלי חיים טרנסגניים בשלב L4 לצלחת המכילה 0.04 mg/mL של 5-fluoro-2'-deoxyuridine.
אנלוג נוקלאוטידי זה מונע את התפתחות הדור הבא על ידי עיכוב סינתזת ה-DNA. מכיוון שפלטות FDUR רגישות לאור, הגנו אותן מהאור על ידי שמירת הפלטות תחת כיסוי ועטיפה מלאה. הכינו פד הג'ל (agar pad) לצורך ניתוח התולעים.
יש להשתמש באלו כשהן טריות ולא להניח להן להתייבש. הניחו שתי זכוכיות מיקרוסקופ שעליהן מודבק פס סרט לאורכן. הסרט משמש כסבב (spacer) ליצירת רפידות בעובי שווה.
הניחו זכוכית כיסוי שלישית ביניהם על משטח העבודה. הם כעת ממוקמים. שלושה זה לצד זה.
הנח טיפה של שעווה מותכת במרכז השקופית והנח במהירות שקופית נוספת מעליה, בניצב לשתי השקופיות הראשונות וברוחב של שלוש השקופיות. חזור על הפעולה כדי להכין מספר פדים נוספים, לפי מספר הדגימות המיועדות לניתוח. לאחר שהפדים של השעווה מוכנים, הנח טיפה של 6 µL של חומר הרדמה בריכוז 3 mM על זכוכית כיסוי בגודל 22 על 30 מילימטר.
העבירו 40 בעלי חיים בוגרים לתוך הטיפה ולאחר מכן הפכו את מכסיות הזכוכית על גבי פד האגרוס. חזרו על הפעולה עבור כל אחד מהקוים הנוספים. בדקו 30 בעלי חיים לכל קו כדי לקבוע את נוכחותם של כל CEP ושל נוירון D.
באמצעות מיקרוסקופ مرکב עם פלואורסצנציית epi בקוביות פילטר המאפשרות ויזואליזציה של FITC או GFP, נשתמש בקוביות פילטר endo G-F-P-H-Y-Q להקלטת נתונים בגיליון דירוג. בעלי חיים מסוג wild type שומרים על GFP מלא בשיעורים בכל ארבעת נוירוני ה-CEP ובשני נוירוני ה-A DE. בעלי חיים בודדים המראים אובדן של נוירוני D מדורגים כ-wild type ידוע או כניווניים.
נוירונים אלה נרשמים כ-LG או אובדן של GFP. באופן דומה, ניתן להעריך את היקף הניוון על ידי ספירת סך הנוירונים שאבדו בכל בעל חיים, וכן את האוכלוסייה; יש לחזור על הניתוח פעמיים נוספות, תוך שימוש ב-30 בעלי חיים נוספים לכל קו בכל ניסוי.
מחושב ממוצע של מספר התולעים הכולל שהפגינו נוירוני דופמין מסוג הפרא (wild type) משלוש סבבי הניתוח. לאחר מכן, מבוצע ניתוח סטטיסטי להגנה עצבית באמצעות מבחן t של student (student's T-test), כאשר ערך P נמוך מ-0.05 נחשב למשמעותי. כדי להשוות בין תולעי ביקורת לבין זנים המבטאים יתר של גנים מועמדים בנוירוני דופמין, יש לבצע ניתוח זה בימים שונים לאחר השכת הביצים, כאשר ימי הניתוח המתאימים נקבעים באופן אמפירי.
לדוגמה, קבענו כי 77%, 87% ו-90% מהבעלי חיים עם alpha CLE פלוס GFP מראים נוירונים דופמינרגים מנוונים ביום השישי, השביעי והעשירי לאחר הפיתוח, בהתאמה. לכן, אם נחזה כי הגן התחליפי (transgene) המדובר עשוי להגביר את הניוון העצבי, נבצע את הניתוח ביום השישי. באופן דומה, גן תחליפי שעשוי לדכא ניוון עצבי ינותח בימים השביעי והעשירי.
הראינו לכם כיצד לבצע בדיקת ניוון עצבי של דופמין ב-sea elegance. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור: ראשית, להשתמש במרקר מתאים לבחירה במהלך הכלאות גנטיות. שנית, להשתמש בזכרים בריאים וב-L four HEDIS עבור ההכלאות.
שלישית, ודאו שאתם מסמנים בזהירות ובעקביות את נוירוני CEP ו-DE. הליך זה יאפשר לכם לבצע סריקה מהירה של גורמים גנטיים שעשויים להגביר או לדכא את הניורודגנרציה המושרית על ידי alpha-CLE. זהו זה.
תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים כיצד להשתמש ב-C. elegans להערכת ניוון עצבים דופמינרגיים כמודל למחלת הפרקינסון. סריקות גנטיות משמשות לזיהוי גורמים המגבירים את הניוון או בעלי השפעה נוירו-פרוטקטיבית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ניורודגנרציה
- גנטיקה
רקע
- *C. elegans* משמש כאורגניזם מודל למחקר של מחלות נוירולוגיות.
- נוירונים דופמינרגיים הם קריטיים להבנת מחלת הפרקינסון.
- מניפולציה גנטית עשויה לחשוף גורמים נוירופרוטקטיביים.
- ניתן להשתמש בבדיקות (Assays) כדי להעריך את ההשפעה של גנים שונים על בריאות נוירונים.
מטרת המחקר
- להערכת ניוון של נוירונים דופמינרגיים ב-C. elegans.
- לזיהוי גורמים גנטיים המשפיעים על ניוון עצבי.
- לבחינת מנגנונים פוטנציאליים לנוירופרוטקציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכלאה של זני תולעים עם ניוון עצבי דופמינרגי עם זנים טרנסגניים.
- ביצוע בדיקות ניוון להערכת בריאות הנוירונים.
- שימוש בסריקות גנטיות לזיהוי גנים מועמדים.
- ניתוח ההשפעות של גנים המבוטאים ביתר על ניוון נוירונים.
תוצאות עיקריות
- הדגיש את התועלת בשימוש ב-C. elegans לחקר מחלת פרקינסון.
- זיהה מספר גורמים גנטיים המשפיעים על דגנרציה של נוירונים.
- הראה השפעות נוירופרוטקטיביות פוטנציאליות של גנים מסוימים.
- סיפק תובנות לגבי המכניזמים של ניורודגנרציה.
מסקנות
- C. elegans הוא מודל יעיל לחקר בריאותן של נוירונים דופמינרגיים.
- סריקות גנטיות יכולות לחשוף תובנות חשובות לגבי תהליכים נוירודגנרטיביים.
- מחקרים עתידיים עשויים להוביל למטרות טיפוליות חדשניות למחלת הפרקינסון.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תיקוף של מועמדים לגנים למחלת הפרקינסון דורש מערכות מודל חזויות ואמינות, המאפשרות הפחתת סיכונים מכניסטית בשלב מוקדם של תהליך הגילוי. בדיקת דגנרציה של נוירוני דופמין ב-C. elegans מספקת פלטפורמה כמותית וניתנת לטיפול גנטי לצורך תיקוף פונקציונלי ותיעדוף של מטרות. גישה זו תומכת במיון תיקי פיתוח על ידי הבחנה בין מודולטורים בעלי פוטנציאל תרגומי לבין מובילים שאינם ברורים מבחינה מכניסטית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה תפקודית של גנים מועמדים למחלת פרקינסון במערכת חיה ומוגדרת גנטית.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי מדידה ישירה של פנוטיפים של ניוון עצבי הקשורים לביטוי alpha-synuclein אנושי.
- מסייע במיון מהיר של רשימות גנים ממחקרי אסוציאציה גנטית באמצעות תיקוף in vivo.
- מספק ביטחון תחזיתי עבור קידום מטרות גניות למודלים מסדר גבוה יותר.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק קריאה כמותית הניתנת לשחזור של הישרדות נוירונים דופמינרגיים באמצעות סמני GFP.
- מנ 표준 את הערכת הניוродеגנציה (ניוון עצבי) על פני מספר קווי תרגנסים יציבים וחזרות.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה (Scalable) של השפעות ביטוי יתר או דיכוי של גנים על רעילות alpha-synuclein.
- מכין מערכות ביולוגיות מאושרות עבור תהליכי סריקת תרכובות או סריקה גנטית בהמשך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מנגנונים רלוונטיים למחלה באמצעות מידול של ניורודגנרציה המושרה על ידי alpha-synuclein.
- תומך ברציפות מהגילוי הגנטי ועד לתיקוף פרה-קליני של גורמים נוירופרוטקטיביים או פתוגניים.
- מספק פלטפורמה לתיקוף מטרות בין-מינית, כולל תרגום של תוצאות מסריקות גנטיות בשמרים.
- מסייע בקבלת החלטות מותאמות סיכון לגבי קידום מטרות גנים, בהתבסס על נתוני נוירופרוטקציה או רעילות in vivo.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
בדיקה זו מגשרת בין גילוי גנטי מוקדם לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקה מונחית-היפותזה של גנים מועמדים במודל של בעלי חיים חיים. היא תומכת בזרימות עבודה החל מזיהוי מטרה, דרך תיעדוף מובילים ועד להפחתת סיכונים מכניסטיים.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת השערת האפס עבור תפקוד גנים במסלולי ניוון עצבי.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים וסטנדרטיים להשוואת השפעות גנים על הישרדות נוירונים.
- אנליזה: עושה שימוש בניתוח סטטיסטי (Student's t-test, p<0.05) כדי לקבוע את המובהקות של נוירופרוטקציה או רעילות.
- מחקר תרגומי: מתקפת ממצאים גנטיים בין מינים שונים ומסנכרנת אותם עם פנוטיפים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת לשימוש חוזר ובקנה מידה משתנה למאמצים מתמשכים של תיקוף גנים ומסלולים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בבחירת המטרה ומפחית עמימות מכניסטית.
- ערך תפעולי: מספק בדיקות in vivo סטנדרטיות, הניתנות לשחזור וניתנות להרחבה לצורך תיקוף גנים.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או עצירה (go/no-go) וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום מטרות גנים עבור תוכניות למחלות נוירודגנרטיביות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בגנטיקה של C. elegans, טרנסגנזה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- נדרשת גישה לציוד להזרקה מיקרוסקופית, מיקרוסקופים מורכבים ומערכות מסננים פלואורסצנטיים.
- נדרש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לגבי פרוטוקולי דירוג וניתוח סטטיסטי.
- התאמה למודלים אחרים של ניוון עצבי עשויה לדרוש אופטימיזציה של פרומוטרים או סמנים.
- התפוקה מוגבלת על ידי דירוג ידני ויצירת קווים טרנסגניים יציבים.
