חלבון התגבשות של קריסטלוגרפיה רנטגן

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להפיק גבישי חלבון עבור ניסויי עקיפה של קרני X. מוצגות שלוש טכניקות שונות לסריקת גבישים; עבור התגבשות בדיפוזיית אדים מתוארות שיטות של טיפה תלויה (hanging drop) וטיפה יושבת (sitting drop), וכן מתוארות שיטות התגבשות במיקרו- 배치 (micro batch) עבור התגבשות בדיפוזיית אדים. הבארות ממולאות בחומר משקיע.

לאחר מכן, מערבבים דגימה של חלבון מנוקה בריכוז גבוה עם חומר המשקיע. את הטיפה המעורבבת אוטמים בתוך באר המכילה את תמיסת המשקיע. תהליך הגבשת מיקרו-באץ' (Micro batch crystallization) מתחיל במילוי הבאר בשמן פראפין.

לאחר מכן טוענים את החלבון אל הבארות, ולאחריו את תמיסת המשקיף. השלב הסופי בכל השיטות הוא להמתין להגעה של המערכת לשיווי משקל ולעקוב אחר הופעתם וצמיחתם של הגבישים בתוך הטיפות. בסופו של דבר, ניתן להפיק גבישים בטכניקה זו ולקבוע את תבנית העקיפה של החלבון באמצעות מקור קרני x עם גלאי מתאים.

שלום, אני סאל מהמעבדה של פרופסור Yoga Motis במחלקה לביופיזיקה מולקולרית וביוכימיה באוניברסיטת Yale. היום נדגים בפניכם פרוצדורה לגביש של חלבון מנוקה. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את הבסיס המבני של זיהום נגיפי.

אם כן, נתחיל ונגדל כמה גבישים. כדי לזהות שיטת התגבשות עבור מקרו-מולקולה נבחרת, ניתן לבצע סריקות ראשוניות באמצעות תמיסות התגבשות זמינות מסחרית, שנבחרו כדי לנצל את שיטת המטריצה הדלילה (sparse matrix incomplete factorial method) של תנאי ניסוי. תנאים אלו נבחרים על בסיס תנאי התגבשות ידועים והנחשבים לבעלי סיכויי הצלחה גבוהים עבור מקרו-מולקולות.

ברגע שתנאי ההתגבשות ידועים, ניתן להקים סריקה צרה המבדילה את ריכוז המשקיע בערכי pH שונים סביב ה-hit המקורי. בדרך כלל, תנאי ההתגבשות המשמשים לסריקות אלו מורכבים מחומר משקיע ומבफर לקביעת ה-pH; עבור הדגמה זו, יש לסנן את כל תמיסות המקור דרך מסנן של 0.22 מיקרון. תנאי ההתגבשות שזוהו קודם לכן עבור ליסוזום מעוף משמשים כאן עם sodium chloride כחומר המשקיע; יש להתחיל את הפרוצדורה בהכנת תמיסות בנפח של 1 מיליליטר בריכוזים שונים של sodium chloride ב-0.1 מולארי sodium acetate בערכי pH שונים.

בשלב הבא, הפשיר את דגימת החלבון המאוחסנת ב-80°C- ושמור אותה על קרח. ריכוזי חלבון טיפוסיים הם בטווח של 5 עד 50 mg/mL, כאשר ריכוזים גבוהים יותר מעניקים בדרך כלל תוצאות טובות יותר. במקרה זה, נעשה שימוש בתמיסה של 50 mg/mL של ליסוזים מביצת תרנגולת ב-0.02 M sodium acetate ב-pH 4.9.

סובב את הדגימה במשך 15 דקות ב-18,000 G ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס כדי להסיר חלבונים שaggregated חלקית או משקעים שנוצרו בשלב ההפשרה. אגרגטים אלו עלולים להפריע לגדילת הגביש ולעודד אגרגציה נוספת. לאחר הצנטריפוגציה.

קבע את ריכוז החלבון על פי הבליעה שלו באורך גל של 280 ננומטר באמצעות פוטומטר UV. ניתן לחשב את ריכוז החלבון מנתון הבליעה וממקדם האטילה של החלבון. לאחר שדגימת החלבון מוכנה, מלא מגש גבישה של 24 בארות בשיטת טיפה תלויה (hanging drop) ב-500 microliters של תמיסת משקיף, בהתאם למפת המגש.

צרו טבעת של גריז סיליקון מסביב לקצה של כל באר, מבלי לסגור את הטבעת באופן מוחלט כדי לאפשר לאוויר לברוח מהתקרה של הבאר. נקו את זכוכית הכיסוי באמצעות ספריי אוויר דחוס או מטלית מקצועית כדי למנוע הצטברות אבק, דבר שיקל על פירוש טיפות הגבישה וימנע זיהומים. השלב הבא הוא פפיט של נפחים שווים של דגימת החלבון ותמיסת המאגר אל על זכוכית הכיסוי.

עם זאת, ניתן לנסות נפחים שונים של חלבון וחומר משקיע כחלק מתהליך האופטימיזציה; שימוש בכמות חלבון הגדולה יותר מכמות החומר המשקיע יביא לריכוז נקי של החלבון בטיפה שהגיעה לשיווי משקל, דבר שעשוי להיות רצוי עבור דגימות חלבון דלילות או כדי להאט את גרעון הגבישים או את צמיחתם. לצורך הדגמה זו, שני µL של lysozyme בריכוז 50 mg/mL ב-0.02 M sodium acetate ב-pH 4 נטענים למרכז זכוכית הכיסוי, ולאחריהם שני µL של תמיסת גביש.

בעת פפיטציה של החלבון ותמיסת המאגר (reservoir solution) אל על זכוכית הכיסוי, יש להיזהר מאוד כדי למנוע היווצרות בועות, שמתרחשת לעיתים קרובות כאשר אוויר נדחף החוצה מהפפיטה. ערבבו בעדינות את הטיפה כדי לסייע במניעת שיקוע מוקדם של חלבונים עקב ריכוזי משקיע (precipitant) גבוהים באופן מקומי בטיפה; ערבוב חשוב במיוחד עבור משקיעים צמיגיים כגון polyethylene glycol, וזאת באמצעות פינצטה. הפכו בעדינות את זכוכית הכיסוי והניחו אותה על טבעת הגריז מעל הבאר; בצעו זאת בתנועה כיוונית כך שניתן יהיה לאוויר לברוח מהבאר.

אחרת, האוויר עלול להרים את כיסוי הזכוכית ולפגוע באיטום הבאר. המשיכו לבאר הבאה עד להשלמת המגש. לאחר הגדרת המגש, בצעו בדיקה ויזואלית והסירו חלקיקי אבק ומזהמים אחרים שעלולים להוביל לזיהוי שגוי (false positive) של גבישי חלבון.

השתמשו בגיליון ניקוד כדי לתעד את הניסוי. לאחר מכן, הניחו את המגש בטמפרטורת הדגירה הרצויה, בדרך כלל בין 4 °C לטמפרטורת החדר. הטמפרטורה המוצלחת ביותר היא 20 °C.

יש להקפיד על טיפול עדין במגש ולהימנע מרעידות, ויברציות או שינויי טמפרטורה במהלך ההעברה או האינקובציה, שכן אלו עלולים למנוע צמיחת גבישים או להשפיע לרעה על איכות הגבישים. יש לבדוק את המגש לאיתור גבישים למחרת ולאחר מכן מדי כמה ימים, תוך הקפדה תמידית על טיפול זהיר במגשים. יש לתעד כל ממצא ומורפולוגיה של טיפות בגיליון ניקוד ספציפי למגש.

בדרך כלל גבישים מופיעים תוך יומיים עד חמישה ימים, אם כי לעיתים הם מופיעים כמעט באופן מיידי או לאחר מספר חודשים. ברגע שתנאי ההתגבשות זוהו וקצב הצמיחה של הגבישים ידוע, מומלץ להשאיר את המגשים ללא הפרעה עד להופעת הגבישים ועד שהם יגדלו לפחות למחצית מגודלם הסופי. השארת המגשים ללא הפרעה עשויה להפחית את מספר אירועי הגרעין של הגבישים, ובכך להוביל למספר קטן יותר של גבישים גדולים יותר; עבור התגבשות בשיטת טיפה מונחת (sitting drop) יש לפעול לפי אותו הליך כפי שבוצע בשיטת טיפה תלויה (hanging drop), למעט העובדה שנשתמש במגש טיפה מונחת בעל 24 בארות שבו אין צורך בזכוכיות כיסוי.

במקום זאת, הבאר מכילה מדף שעליו מערבבים את החלבון ואת המשקיע באמצעות פיפטה; העברו 2 µL של תמיסת lysozyme בריכוז 50 mg/mL למרכז המדף, תוך הימנעות מיצירת בועות אוויר. לאחר מכן, לאחר הגדרת המגש, הוסיפו 2 µL של תמיסת משקיע לדגימה. אטמו את הבארה באמצעות סרט אופטי בשיטת טיפה יושבת (sitting drop).

אין צורך בזכוכית כיסוי. המשך את האינקובציה ואת דירוג הגבישים כפי שמתואר בשיטת הטיפה התלויה. לביצוע הליך של מיקרו-בצ' (micro batch).

הכינו את תמיסת הגביש והחלבון כפי שתואר עבור פרוצדורת הטיפה התלויה (hanging drop). השתמשו במגש micro batch חדש ובספריי אוויר כדי למנוע חדירת אבק וחלקיקים גדולים אחרים למגש ה-micro batch. הוסיפו שמן פראפין לכל באר עד לעומק של 3 מילימטרים.

לאחר מכן הסירו את עודפי השמן. כעת טענו מיקרוליטר אחד של תמיסת החלבון אל הבאר הממולאת מראש, תוך וידוא שהטיפה שוקעת לתחתית הבאר. לאחר מכן טענו מיקרוליטר אחד של תמיסת המשקיף אל הבאר.

וודאו שהטיפה שוקעת לתחתית הבאר ומתמזגת עם טיפת החלבון. עברו לבאר הבאה עד לסיום המגש והמשיכו בדגירה ובניתוח הגבישים כפי שמתואר כאן. תוצאות טיפוסיות של התגבשות חלבונים.

הניסויים מוצגים. שקיעה אמורפית מתרחשת כאשר החלבון ו/או החומר המשקיע נמצאים בריכוז גבוה. לעומת זאת, טיפות שאינן רוויות נשארות בדרך כלל צלולות.

הפרדה פאזית עשויה להתרחש אם החלבון או הדטרגנט נפרדים לפאזה שונה כאשר הם מעורבבים עם משקיעים מסוימים בריכוז גבוה. בתנאים אופטימליים, אמורים להיווצר גבישי חלבון של Arabidopsis csn. שבעה גבישי חלבון שהתקבלו ב-polyethylene glycol 8,000 ובמגנזיום אצטט נראים בצורת מוט.

הגבישים המוצגים הם גם גבישי חלבון ליזוזום שהתקבלו ב-1 molar של sodium chloride ו-sodium acetate, pH 4.9. סרט time-lapse זה מדגים שגבישי ליזוזום גדלים למ prismas גדולים תוך מספר שעות מההקמה כאשר משתמשים בשיטת ה-hanging drop.

הרגע הצגנו בפניכם כיצד להכין ניסוי חלבון בעת ביצוע פרוצדורה זו. חשוב לעבוד בסביבה עם בקרה יציבה של טמפרטורה ולחות, שכן לחות גבוהה מסייעת לצמצם את התאיידות הטיפה; נסו לאמץ טכניקה הממזערת את חשיפת הטיפה לאוויר הפתוח. מסיבה זו, חיוני לעבוד בסביבת עבודה מאורגנת היטב.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.