התגבשות חלבון בתפוקה גבוהה באמצעות מיקרודיאליזה
3 במרץ 2023
הפרוטוקול המוצג מתאר גישה פשוטה לסינון תנאי התגבשות חלבונים וגדילת גבישים באמצעות צלחת דיאליזה בעלת תפוקה גבוהה של 96 בארות. השימוש בשפופרות דיאלייזר לגידול בקנה מידה גדול של מיקרו-גבישים מודגם גם עבור קריסטלוגרפיה טורית ויישומי MicroED.
התגבשות על ידי דיאליזה היא שיטה לא מנוצלת. פרוטוקול זה מציג גישה נובו לכך, אשר תגדיל את מגוון אסטרטגיות ההתגבשות הקיימות כיום לקביעה מובנית. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא בעלת תפוקה גבוהה, פשוטה להתקנה ללא צורך בציוד מיוחד, ומאפשרת ניטור קל של צמיחת גבישים.
האדם המבצע טכניקה זו חייב להיות נוח עם pipetting נפח נמוך באמצעות פיפטות רב ערוציות. יש להקפיץ את הטיפות בצורה מספקת ככל האפשר כדי למנוע התייבשות חלקית. כדי להגדיר את ניסוי המיקרודיאליזה, הניחו צלחת מיקרודיאליזה מסחרית של 96 בארות בכיוון צד החלבון כלפי מעלה והסירו את סרט הכיסוי הדביק על ידי קילוף ספייסר הדבק בלחץ 200 מיקרון.
לאחר קילוף סרט הכיסוי הדביק, שים לב למיקום של באר A1. לאחר מכן, באמצעות פיפטה רב ערוצית, לטעון מקסימום של 3.2 מיקרוליטר של דגימת חלבון מוכן כראוי לתוך כל באר. מקם כראוי את סרט כיסוי UV של 200 מיקרון מעל צלחת 96 בארות כאשר הסרט פונה כלפי מעלה. לאחר מכן, כדי להפעיל ולאטום את דבק הלחץ, לחץ על סרט כיסוי UV באמצעות משוט איטום ובדוק את תקינותו.
כעת, הפוך את הצלחת כדי להביא אותה לכיוון צד החיץ כלפי מעלה ושים לב למיקום המראה של הבאר המסומנת A1. באמצעות פיפטה רב ערוצית, לטעון מקסימום של 350 מיקרוליטר של תמיסת הדיאליזה לתוך כל באר של הצלחת בזהירות לאטום את הבארות עם סרט כיסוי המאגר. לאחר מכן, הניחו את הצלחת בכיוון צד החיץ כלפי מעלה בתוך אינקובטור מבוקר טמפרטורה מתאים בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס כדי לאפשר צמיחת גביש. כדי לבחון את היווצרות הגביש מתחת למיקרוסקופ, הסר את סרט הכיסוי המגן מסרט כיסוי UV של 200 מיקרון והנח את הצלחת מתחת לעינית כאשר צד החלבון פונה כלפי מעלה.
כדי להקים ניסוי התגבשות בקנה מידה גדול, אמצו את התנאים שבהם התרחשה צמיחת מיקרו-גבישים בלוח המיקרודיאליזה ושחזרו את אותם תנאים במיכלים גדולים. בחר את גודל המיכל בהתאם לנפח תמיסת הדיאליזה. פיפטה בנפח מרבי של 500 מיקרוליטר דגימת חלבון לתוך צינור הדיאליזר לפני אטימת הצינור באמצעות מכסה הפלסטיק האדום.
הניחו את צינור הדיאליזר האטום בנפח 500 מיקרוליטר במדף הצף בתוך המיכל המלא בתמיסת דיאליזה. לאחר מכן, הניחו את המיכל ללא הפרעה בתוך אינקובטור מתאים מבוקר טמפרטורה ב 20 מעלות צלזיוס כדי להשיג צמיחה גבישית. כדי לבדוק היווצרות של גבישים, פיפטה אחד עד שני מיקרוליטר של התמיסה מן dialyzer על שקופית כיסוי זכוכית.
כסו את התמיסה בשקופית זכוכית נוספת וצפו בה תחת מיקרוסקופ. תמונות שצולמו באמצעות מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה גבוהה הראו היווצרות מוצלחת של מיקרו-גבישים של ארבעה חלבונים באמצעות לוחות מיקרודיאליזה עם ממברנות חיתוך משקל מולקולרי של 10 קילודלטון. ליזוזים נמצא כיוצר גבישים כאשר הוא מחויג כנגד נתרן אצטט מולארי 0.1 ב-pH 4 המכיל תוספים מתאימים.
דומאטין יצר גבישים כאשר חוגגו כנגד פרופאן ביס-טריס מולארי 0.1 ב-pH 6.6 המכיל תוספים מתאימים. תנאי דיאליזה אופטימליים הובילו להיווצרות מיקרו-גבישים על ידי חלבוני הממברנה, כלומר חלבון משאבת השטף הרב-תרופתי E.coli AcrB וטרנספורטר הלקטוז E.coli LacY. התגבשות בקנה מידה גדול בצינורות הדיאליזר תוך שימוש בתנאי הדיאליזה האופטימליים שהתקבלו מניסויי המיקרודיאליזה הובילה להיווצרות אלפי מיקרו-גבישים לכל אחד מהחלבונים.
לצורך התגבשות של פומיטין, 250 מיקרוליטר של חלבון היה dialyzed מול 50 מיליליטר של תמיסת דיאליזה. עבור AcrB, 250 מיקרוליטר של החלבון חוגו כנגד 25 מיקרוליטר של תמיסת דיאליזה. גם התגבשות LacY נקבעה באותו יחס, עם 100 מיקרוליטר חלבון ל-10 מיליליטר תמיסת דיאליזה.
בעת היפוך הצלחת לצד החיץ כלפי מעלה, חשוב לשים לב למיקום של A1, כך שניתן יהיה לחלק פתרונות ממסך ההתגבשות בהתאם. הגבישים המתקבלים משיטה זו יכולים לשמש ליישומים במורד הזרם, כגון קריסטלוגרפיה טורית ומיקרו ED.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה בthroughput גבוה לסריקת תנאי התגבשות של חלבונים באמצעות פלטת מיקרודיאליזה בעלת 96 בארות. הוא מדגים גידול של מיקרו-גבישים עבור יישומים בקריסטלוגרפיה סריאלית וב-MicroED.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גיבוש חלבונים
- ביולוגיה מבנית
- טכניקות קריסטלוגרפיה
רקע
- גיבוב על ידי דיאליזה היא שיטה פחות נפוצה בגיבוב חלבונים.
- גישה זו מרחיבה את מגוון האסטרטגיות הזמינות לגיבוב.
- היא מועדפת בשל פשטותה ויכולתה לתפוקה גבוהה.
- ניטור הצמיחה של הגבישים הוא פשוט בשיטה זו.
מטרת המחקר
- להציג גישה חדשנית לגבישון חלבון.
- להקל על גידול רחב-היקף של מיקרו-גבישים.
- לאפטם תנאים ליישומים של קריסטלוגרפיה סדרתית ו-MicroED.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בלוחית מיקרודיאליזה בעלת 96 בארות לצורך התגבשות.
- טעינה של דגימות חלבון ותמיססות דיאליזה לתוך הבארות.
- דגירה בבקרת טמפרטורה לצמיחת גבישים.
- בדיקה מיקרוסקופית של היווצרות הגבישים.
תוצאות עיקריות
- היווצרות מוצלחת של מיקרו-גבישים עבור חלבונים מרובים.
- תנאים מותאמים הובילו להיווצרות של אלפי מיקרו-גבישים.
- זוהו תנאים ספציפיים עבור lysozyme, domatin, AcrB ו-LacY.
- ניתן להשתמש בגבישים שהיווצרו ליישומים המשכיים.
מסקנות
- השיטה מספקת דרך מהימנה לסריקת תנאי התגבשות.
- היא מאפשרת התאמה קלה של קנה המידה של ניסויי התגבשות.
- הגישה מועילה לקביעה מבנית של חלבונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גידול גבישים של חלבונים בתפוקה גבוהה באמצעות מיקרודיאליזה מאפשר סריקה מהירה של תנאי התגבשות, ובכך תומך בתהליכי עבודה של ביולוגיה מבנית וגילוי תרופות. זרימה זו של עבודה מגבירה את הביטחון החזוי באישור מטרות מבוסס מבנה ומאיצה את המעבר משלב הגילוי למחקר פרה-קליני. הגישה היא ניתנת להרחבה, חסונה ותואמת ליישומים המשכיים כגון קריסטלוגרפיה סדרתית ו-MicroED.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מקל על בחינה מהירה של קשרי מבנה-תפקוד של חלבונים לצורך תיקוף מטרות.
- מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי אספקת נתונים מבניים ברזולוציה אטומית.
- תומך במיון תיקי פיתוח באמצעות זיהוי מטרות ניתנות לטיפול (tractable) באמצעות תובנות מבניות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין גבישי חלבון מאושרים לצורך סריקה המשכית ובדיקות ביופיזיות.
- מסטנדרט את תנאי ההתגבשות באמצעות פלטות בעלות 96 בארות התואמות לתקן SBS לצורך הדירות.
- מאפשר ייצור בר-הרחבה של מיקרו-גבישים עבור פלטפורמות לסריקה בסריקה גבוהה.
- תומך בהערכה מהימנה של אינטראקציות חלבון-ליגנד בתכנון תרופות מבוסס מבנה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה נתונים מבניים למטרות חלבון הרלוונטיות למחלה לצורך פיתוח ביומרקרים תרגומיים.
- מבטיחה רצף משלב הגילוי של בירור המבנה ועד למחקרי תיקוף פרה-קליניים.
- מפחיתה את הסיכון בקידום מועמדים על ידי אספקת ראיות מבניות חסונות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטת הגבישה זו, המבוססת על מיקרודיאליזה, משתלבת באופן רציף משלב הגילוי המוקדם דרך זיהוי המולקולות המובילות (lead identification) ועד למחקר פרה-קליני, ובכך היא תומכת באופטימיזציה איטרטיבית מונחית-מבנה.
- ביולוגיית גילוי: מאפשרת בדיקת השערות והבהרת מסלולים באמצעות ניתוח מבני בסינון רחב (high-throughput).
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך פיתוח בדיקות וסריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת גבישים באיכות גבוהה המתאימים למדידות דיפרקציה של קרני X ואלקטרונים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי תמיכה בתיקוף של סמנים ביולוגיים ומטרות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה סטנדרטית וניתנת להרחבה לשימוש חוזר במגוון מטרות חלבוניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף יעדים.
- ערך תפעולי: מספק תהליכי עבודה לקריסטליזציה סטנדרטיים, ניתנים לשחזור וניתנים להרחבה.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go ויעילות הון על ידי מתן תובנות מבניות חסונות בשלב מוקדם.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בסדר עדיפויות מותאם סיכונים וקידום של יעדים המתוקפים מבנית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בחלבונים ובטכניקות פיפטינג לנפחים נמוכים.
- נדרש גישה לתשתית מעבדה סטנדרטית לקריסטליזציה ולמיקרוסקופיה לצורך ניטור.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור הגדרת הפלטות ופירוש הנתונים.
- ניתן להתאמה למגוון רחב של מחלקות חלבונים, כולל חלבונים ממברנתיים, כפי שהודגם.
- מוגבל על ידי מסיסות ויציבות החלבון בתנאי דיאליזה, כפי שצוין בפרוטוקול.
