ממברנה פוטנציאלים, התגובות Synaptic, המעגלים הנוירונים, Neuromodulation ו היסטולוגיה שרירים שימוש סרטן הנהרות: מעבדה תרגילים סטודנטים

המטרות הכלליות של הניסויים הבאים הן להבין את תכונותיהן של ממברנות ברגיעות (excitable membranes) ואת הבסיס היוני של פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה, וללמוד שיטות למדידת פוטנציאל הממברנה וכן להדגים תכונות של העברה סינפטית. בחלק אחד של הניסוי, יימדד פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה תוך שינוי ריכוז האספיד (potassium) החוץ-תאי. בחלק אחר של הניסוי, ייבחנו מנגנונים של דיפרנציאציה סינפטית באמצעות רישום של תגובות סינפטיות מעוררות ביחידות מוטוריות שונות.

בשלב הבא, מוצג מעגל עצבי שקל לתחזק. ניתן להשתמש בהכנה זו למטרות הוראה וכן למחקר של היבטים שונים במעגל המקשר בין קולטן חושי למערכת העצבים המרכזית (CNS), משם לנוירון מוטורי ולשריר. סדרת ניסויים זו מדגימה את הקלות שבה ניתן להשתמש במודל של סרטן הנהר לבחינת סוגיות הנוגעות לפוטנציאל ממברנה, אינטגרציה סינפטית והולכה, והבדלים מבניים בין סוגי סיבי שריר.

היתרונות העיקריים בשימוש בהכנה של סרטן נחל להוראת מושגים וטכניקות אלקטרופיזיולוגיות הם קלות הניתוח, חיוניות ההכנה במינרליים מינימליים, הקלה בהשגת תגובות סינפטיות, והקלות בזיהוי המבנה האנטומי הכללי של השרירים. ניתן ליישם טכניקות אלו גם על הכנות אחרות, והן יקדמו את הבנתנו לגבי פיזיולוגיה ומודולציה סינפטית, וכן לגבי הבדלים ביוכימיים ומבניים בהכנה שהודגמה. כדי להתחיל בניתוח, בחרו סרטן נחל באורך גוף של כ-6 עד 10 סנטימטרים והניחו אותו בקרח גרוס למשך חמש דקות כדי להרדימו. כדי לערוף את ראש הסרטן, החזיקו אותו מאחורי הראש, תוך הקפדה שהאצבעות לא יהיו בטווח הגעה של צבתות ופיו של הסרטן, והשתמשו במספריים גדולים.

הסיר במהירות את הראש באמצעות חיתוך נקי מאחורי עיני סרטן המים המתוקים, והסר את הרגליים והצבתים כדי למנוע פציעות. הסר את ה-styles בזכרים ואת ה-swimmerets הן בזכרים והן בנקבות. השליך את הראש ואת האיברים התלויים.

בשלב הבא, הפר את הבטן מהחזה על ידי ביצוע חתך לאורך קרום המפרקים המחבר בין הבטן לחזה. שמור את חלק הבטן של סרטן המים המתוקים והשליך את החזה; תוך הפניית המספריים מעט כלפי מטה לכיוון הצד הגחוני ובזווית, בצע חתך בשריון לאורך הגבול הצדי התחתון של כל צד של הבטן. היזהר לא לחתוך עמוק מדי לתוך הסרטן.

בעזרת פינצטה, עקבו אחר דפוס הקווים הטבעי של שריון הסרטן המתרחב לאורך כל פלג. הסירו את החלק הגחוני של השריון על ידי משיכתו כלפי מעלה ואחורה, תוך הקפדה שלא להרוס את שרירי הבטן.

הסיר את שרירי הכופף (flexor muscles). בשלב זה, ניתן לראות מסה לבנה של רקמה מעל שרירי הכופף העמוקים. הסר רקמה זו בזהירות באמצעות פינצטה.

מערכת העיכול נראית כעת כצינור קטן השוטה לאורך קו האמצע של שרירי הכיפוף העמוקים. הסירו אותה על ידי צביטה של החלק העליון בעזרת פינצטה ומשיכתה מהבטן. גזרו את החלק התחתון של מערכת העיכול בקצה הזנב.

שטפו את התוצאה של הניתוח בתמיסת סלין כדי להבטיח ששאריות צואה לא יפריעו להכנה. בעזרת סיכות ניתוח, הצמידו את הפינות העליונות והתחתונות של ההכנה למנתרא פטרי מצופה ב-S guard. שרירי הפשיטה של הבטן חשופים כעת.

שפכו תמיסת סלין אל צלחת הפטרי כדי לכסות את הדגימה עד לביצוע ההקלטות התוך-תאיות. העבירו את צלחת הפטרי אל המיקרוסקופ והשתמשו בשעווה מתחת לצלחת כדי למנוע ממנה לזוז. המערך המשמש להקלטות תוך-תאיות מוצג בדמות זו.

החיבורים וההגדרות המתאימים מפורטים בטקסט הנלווה. הגדירו את תוכנת תרשימי המעבדה בהתאם להוראות. בטקסט הנלווה, הכניסו את חוט ההארקה לאמבט הסליין.

הנח את קצה מיקרו-פיפטית זכוכית הממולאת בפוטאסיום כלוריד בריכוז שלושה מולרי לתוך אמבט הסליין ובדוק את התנגדות האלקטרודה. התנגדות האלקטרודה צריכה להיות 20 עד 60 mega ohms. השתמש בכפתור הכיוון הגס במגבר כדי להזיז את הקו בתרשים המעבדה לאפס תחת תאורה בעוצמה גבוהה.

הביטו דרך המיקרוסקופ וזהו את שרירי ה-DEM האורכיים. השתמשו במ probes של האלקטרודה כדי להחדיר את האלקטרודה התוך-תאית לתוך סיב שריר של שריר ה-DEM. יש להחדיר את האלקטרודה לסיב השריר באופן חלקי בלבד.

היזהרו לא לחדור עד לקצה התא. מדדו את האמפליטודה של פוטנציאל המנוחה. גררו את סמן ה-M אל העקבה מהמיקום בפינה השמאלית התחתונה של חלון הגרף.

מקמו את הסמן M על קו הבסיס והזיזו את הסמן (cursor) לנקודה הנמוכה ביותר באות שהוקלט. ההפרש בין הסמן לבין הסמן הפעיל מוצג בצד הימני העליון של המסך. ערך זה הוא המתח של פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה.

חלק את המתח שנמדד במידת ההגברה; במקרה זה נעשה שימוש בהגברה של 10x. לאחר מכן, המר את המתח מוולטים למילי-וולטים. לאחר רישום פוטנציאל המנוחה של סיב השריר, התבונן דרך המיקרוסקופ והוצא בזהירות את האלקטרודה מסיב השריר.

חזור על ההסרטה התו-תאית בסיבי שריר אחרים. החלק הבא של ניסוי זה יבחן את ההשפעה של העלאת ריכוז האשלגן החוץ-תאי על פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה. יעשה שימוש בשישה תמיסות סאליין לסרטנים עם ריכוזי אשלגן של 5.4, 20, 40, 60, 80 ו-100 millimolar.

בחרו שריר שאינו מכווץ לצורך ביצוע ההקלטה התוך-תאית הבאה בין ההקלטות. החליפו את תמיסת האמבט בריכוז הגבוה הבא של תמיסת פוטסיום כלוריד. ודאו כי הדגימה מכוסה לחלוטין בכל פעם.

רשמו את השינויים בפוטנציאל הממברנה עבור כל תמיסה. השפעתה של העלאת ריכוז האשראות החוץ-תאי, פוטנציאל הממברנה מוצג בצילום המסך הזה; שרטטו את פוטנציאלי הממברנה במצב מנוחה עבור כל ריכוז של אשראות בגרף חצי-לוגריתמי של ריכוז אשראות חוץ-תאי לעומת פוטנציאל הממברנה. יישרו את פוטנציאל המנוחה בריכוז של 5.4 millimolar של אשראות חוץ-תאי.

עבור העקומות ההיפותטיות והנצפיות, השו את השיפוע של הקו הנצפה לשיפוע של הקו ההיפותטי. לאחר סיום ההקלטות האלקטרופיזיולוגיות הללו, השלב הבא הוא לבחון את האנטומיה של סיבי השריר ואת דפוס העצבוב שלהם. העבירו את הדגימה לכלי העמידה והוסיפו methylene blue.

לאחר חמש דקות, הסירו את המethylene blue והוסיפו תמיסת מלח טריה עבור crayfish. חפשו את העצב הראשי המעצב את השרירים בתוך סגמנט. שרטטו את תבנית העצב עבור השרירים S-E-M-D-E-L 2D EL one ו-DEM בסגמנט.

בשלב הבא, העבירו את הדגימה תחת מapay מנדף. הסירו את התמיסה הסלינית והוסיפו את המקבע. המקבע המשמש כאן הוא תמיסת פוין (poin solution).

מטרת מ㠃 הפעולה של מapay הריכוזים (fume hood) היא למנוע חשיפה לאדי המקבע. היזהרו מאוד שלא להביא 접יס של תמיסה זו על העור או על העיניים. אם העיניים מתחילות לבעור, שטפו אותן מיד בתחנת שטיפת העיניים.

השאירו את תמיסת ה-boin על הדגימה למשך כ-10 דקות, ולאחר מכן השתמשו בפיפט כדי להחליף את התמיסה בתמיסס סלין. חתכו מקטע דק של שריר DEL one או DEL two. הניחו אותו על תזריזית זכוכית.

סמנו את הזריקה. חזרו על הפרוצדורה עבור שריר ה-SEM. השתמשו במיקרוסקופ קומפאונד כדי לבחון את דפוס הפסי השרירי (sarcomere banding pattern) בשתי דגימות הרקמה.

סדרת הניסויים הבאה תבחן כיצד להקליט תגובות סינפטיות בשרירים הבטניים של סרטני נהר. בחרו סרטני נהר נוסף ובצעו לו דקפיטציה. הסירו את החזה והנספחים וחשפו את השרירים הפושטים של הבטן כפי שמוצג בניתוח.

בחלק הראשון של סרטון זה, השתמשו במיקרוסקופ כדי למצוא את העצב הנושא את האקסונים המוטוריים לשרירי הפושטים (extensor muscles). חפשו את הסגמנט שבו העצב נגיש ביותר. העצב הוא לבן וניתן להבחין בו באמצעות התזת תמיסת סלין על הדגימה בעזרת פיפטה או על ידי נשיפה קלה על הדגימה.

פעולה זו גורמת לעצב לזוז ובכך מקילה על זיהויו. מקמו את אלקטרודת השאיבה המוצמדת למיקרו-מניפולטור ישירות מעל העצב. משכו בעדינות בבנבולה כדי לשאוב את העצב אל תוך האלקטרודה.

ניתן לראות את העצב נשאב אל תוך האלקטרודה דרך המיקרוסקופ. התאימו את ההגדרות בתוכנת תרשימי המעבדה כפי שפורט במאמר המצורף. מלאו מיקרו-אלקטרודת זכוכית עם פתרון KCl בריכוז 3M וחברו אותה למבנה הראש (head stage) ולמערכת ה-PowerLab.

השתמש בכפתור הכיוון הגס (course knob) במגבר כדי להזיז את הקו בגרף המעבדה לאפס. לפני הכנסת האלקטרודה, יש להעביר את מתג ההפעלה למצב "פעיל" (on) ואז למצב "כבוי" (off) מספר פעמים. כדי לבדוק את התנגדות האלקטרודה, מדוד את האמפליטודה של הערכים המתקבלים.

הביטו דרך המיקרוסקופ והשתמשו בProbe של האלקטרה כדי להחדיר את האלקטרה לאחד מסיבי השריר האורכיים, בין אם זהו סיב DEM או סיב DL 1 או DL 2. היזהרו שלא לחדור דרך סיב השריר. ההכנה מוכנה כעת לניסוי.

אלקטרודת השאיבה משמשת לעגיברת צרור העצבים הסגמנטלי ואלקטרודת המיקרו מזכוכית משמשת להקלטת התגובה הסינפטית מסיב השריר; הפעל את ממריץ השתמרים כדי לעורר את העצב בתדר של 1 Hz עבור תגובות פאזיות. לאחר מכן, מקם את האלקטרודה בתוך סיב שריר SEL. ה-SEL הוא שריר טוני.

גררו את העצב בפרצי פולסים קצרים בתדר של 10 hertz כדי להשיג תגובות טוניות. השוו בין התגובות המוקלטות של שרירי ה-DEL ושרירי ה-SEL. שימו לב כי לשרירי ה-DEL הפאזיים תגובות סינפטיות בעוצמה גבוהה יותר מאשר לשרירי ה-SEL הטוניים.

סט הניסויים הבא מתמקד בשרירי הכפיפה (flexor muscles) של סרטן הנהר ולא בשרירי הפשיטה (extensor muscles). התחל עם סרטן נהר חדש ובודד את הבטן כפי שמוצג בניתוח זה. בחלק הראשון של סרטון זה, הנח את דגימת הזנב המבודדת בתוך צלחת פטרי מלאה בתמיסת מלח, וקבע בעזרת סיכות את הזנב ואת החלק העליון של הדגימה.

שים לב כי בניסויים של Caro על שרירי הכיפוף הטוניים, יש להשאיר את חבל העצבים הגבי (ventral nerve cord) שלם. השתמש בסכין מנתחים כדי להתחיל חיתוך לאורכי דרך קרומי המפרק בין שני צלעות בצד הגבי של הדגימה.היה זהיר מאוד שלא לחתוך עמוק מדי בעת ביצוע חיתוך זה, שכן חיתוך עמוק עלול לקטוע את שורש העצב המוטורי, וזאת כדי להבטיח שהשרירים השטחיים לא ייפגעו.

בצע את השלב הבא. בעזרת מיקרוסקופ, גזור בעזרת מספריים או סכין מנתחים חתך אופקי מהחתך האורכי בשכבת הקרום הדקה המכסה את השריר. הגדל את החתך כדי ליצור לסנפיר של קרום המפרק והרם את הלסנפיר כלפי מעלה.

השתמשו במספריים כדי לגזור את הש lieb (הflap), כך שייחשפו שרירי הכופף השטחיים (superficial flexor muscles) לצורך הקלטה תוך-תאית מהשרירים הללו. השתמשו באותם מכשירים ובאותה מערך כפי שנעשה עבור הקלטת פוטנציאל הממברנה במצב מנוחה והתגובות הסינפטיות מהפותרים הבטניים (abdominal extensors). כפי שנעשה קודם לכן, השתמשו באלקטרודה תוך-תאית מלאה ב-potassium chloride בריכוז שלושה מולרי.

החדר את האלקטרודה לתוך סיב שריר של השרירים הכופפים השטחיים, תוך הקפדה לא לחדור דרך השריר. רשום את הפעילות הספונטנית של ה-EPSPs. שים לב לגדלים השונים של ה-EPSPs, והאם קיימים IPSPs כלשהם.

השתמשו במברשת צבע קטנה והברישו בזהירות לאורך קצה הקוטיקולה בתוך אותו סגמנט המכיל את אלקטרודת ההקלטה. שימו לב לכל שינוי בתדירות או בגודל של ה-EPSPs כתוצאה מהגירוי, במידה ונצפית תגובה חזקה יותר. דבר זה יעיד על גיוס של נוירונים מוטוריים נוספים המגיבים לשינוי בירי הפוטנציאלים של העצב התחושתי.

החליפו בזהירות את תמיסת אמבט הסלין לתמיסה המכילה נוירומודולטור, כגון סרוטונין בריכוז של one micromolar, או סלין המבעבע דרכו carbon dioxide. לאחר מכן, חזרו על הגירוי באמצעות מכחול. שימו לב להשפעה שיש להחלפת תמיסת האמבט על הפעילות המוקלטת.

החזירו את תמיסת המלח באמבט למלח פיזיולוגי רגיל והבחינו כי פעילות סיב השריר חוזרת לקו הבסיס. איור זה מציג EPSPs שנרשמו בסיב של שריר כופף שטחי. שימו לב לגדלים השונים של ה-EPSPs.

השלב הבא של ניסוי זה משתמש באלקטרודה חוץ-תאית כדי לנטר פוטנציאלי פעולה מנוירונים מוטוריים המגיבים לפעילות במעגל העצבי מהחיישן למערכת העצבים המרכזית (CNS) ומשם לנוירון המוטורי. התחילו בהכנת אלקטרודת שאיבה לגירוי העצבים החשתיים. משכו חתיכת צינור פלסטיק מעל להבה.

השלב הבא הוא קיצור הפיתול לגודל הרצוי. כדי לעשות זאת, עליכם להביט בעצב בדגימה שלכם כדי להעריך את קוטר הפתיחה הרצוי עבור אלקטרודת השאיבה. בהתאם לגודל הסרטן (crayfish), צרורות העצבים עשויות להשתנות בגודלן מקילומטר אחד בערך ועד למספר מילימטרים בקוטרן.

גזרו את החלק המתוח של הפרו-טובנג (tubing) כדי להביא את הפתח בקצה לגודל הנכון להחזקת העצב. אם הפתח יהיה גדול מדי, העצב עלול להחליק החוצה. אם הפתח יהיה קטן מדי, העצב עלול להיפגע מהלחץ של האלקטרודה.

מקמו את הפחית הפלסטית על קצהו של אלקטרודת שאיבה מזכוכית. הגדרת האלקטרופיזיולוגיה והתוכנה שונה מעט מניטור של תגובות חוץ-תאיות בהשוואה להגדרה של הקלטות תוך-תאיות. בהתאם לציוד המפורט במאמר המלווה, שאבו את הנתיב השלישי המעצב את השריר הכופף השטחי אל תוך אלקטרודת השאיבה.

כעת ניתן להתחיל בהקלטת פוטנציאלי פעולה. נתיב זה כולל חמישה נוירוני מוטוריקה מעוררים ונוירון מוטוריקה מעכב אחד. לאחר הקלטת הפעילות הבסיסית, גרו את הקוטיקולה באמצעות מברשת כדי לצפות בשינוי בפוטנציאלי הפעולה הנוצרים.

לאחר מכן, החליפו את תמיסת האמבט עם נוירומודולטורים כגון serotonin כבניסוי הקודם, והקליטו כל שינוי בתגובה. תרגילים נוספים מופיעים בטקסט הנלווה. הקלטה זו מראה את פוטנציאלי הפעולה שהוקליטו מהנתיב השלישי לפני ובמהלך גירוי של הקוטיקולה באמצעות מברשת; השוו את תדירות פוטנציאלי הפעולה לפני ההברשה לתדירותם במהלך הגירוי.

הקלטה זו מציגה את פוטנציאלי הפעולה שנרשמו מהנתיב השלישי בתמיסת סליין רגילה ובבתמיסת סרוטונין. השוו את תדירות פוטנציאלי הפעולה בסליין רגיל לתדירותם בנוכחות סרוטונין כפי שהוצג זה עתה. גירוי באמצעות מברשת מעלה את תדירות הפריקה ביחס לקו הבסיס.

פעילות זו הוכיחה גם כי סרוטונין מעלה את תדירות הפריקה בהשוואה לתמיסת סליין רגילה. איור זה מראה כי כאשר השחזור וסרוטונין משולבים, קיימת עלייה גדולה עוד יותר בתדירות הפריקה. השוואת ההשפעות של ריכוז אשלגן חיצוני על פוטנציאל הממברנה במנוחה, כפי שנגזרו באופן חיצוני ובאופן תיאורטי, מעידה על השפעת היונים על פוטנציאל הממברנה.

הראינו לכם גם כיצד להקליט תגובות נירו-שריריות במעברים עצביים-שריריים של שרירים פאזיים וטוניים כאחד. ניתן להשתמש בטכניקות אלו במעבדות מחקר לסטודנטים כדי ללמד מושגי יסוד ופיזיולוגיה. ניתן להשתמש בטכניקות שנרכשו בתרגול מעבדה זה כדי לענות על שאלות הקשורות להכנות מעבדה אחרות, וכן ליישומים פיזיולוגיים הקשורים לרפואה ולבריאות.