ניסויים פיזיולוגיים עם במעי האחורי סרטן הנהרות: תרגיל מעבדה סטודנטים
18 בינואר 2011
בדו"ח זה אנו מדגימים טכניקות שיכולות לשמש כדי לחקור את הביולוגיה של סרטנים במעי האחורי. אנו מראים כיצד לנתח בטן סרטנים ותחקור את קשורה, פיזיולוגיה מודולציה של פעילות. פעילות כוח peristaltic של התכווצויות נמדדים באמצעות מתמר כוח.
המטרה הכוללת של דוח זה היא לשמש ככלי הוראה לתלמידי תיכון מתקדמים ולסטודנטים לתואר ראשון בקורסי פיזיולוגיה העוסקים בניסויים פיזיולוגיים. התלמידים לומדים לחשוף ולהקליט התכווצויות במעי האחורי של סרטני מים מתוקים (crayfish). שלב נוסף כולל כריתה של המעי האחורי מהחיה, דבר המאפשר יישום ישיר של תרכובות.
בשלב הבא, מנטרים את העוצמה ואת הקצב של התכווצויות השריר החלק של המעי האחורי תוך יישום של סוכנים פרמקולוגיים שונים, כדי לבחון את המנגנונים המשנים את עוצמת ההתכווצות. התוצאות המתקבלות מראות את השפעתם של המודולטורים על העצבים הפנימיים או ישירות על השריר, בהתבסס על בדיקות פרמקולוגיות ואפיון תתי-סוגים של רצפטורים. שלום, אני ד"ר J Mercier מהמחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת ברוק.
השתמשתי במעי האחורי של סרטן המים כדגימה לביצוע מחקר על מוליכים עצביים השולטים בשרירים visceral. כמו כן, השתמשתי בדגימה זו ככלי הוראה, וכחלק משיתוף פעולה עם המעבדה של Dr.Robin Cooper באוניברסיטת קנטקי, אנו משכללים מספר ניסויים המובלים על ידי סטודנטים למטרות לימודיות. שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תפקודו של המעי האחורי של סרטן המים.
ניתן ליישמו גם במחקרי מחלות, כגון מחלות המערבות מקצבים פריסטלטיים. כמו כן, ניתן להשתמש בו לתיאור המנגנונים העומדים בבסיס המודולציה של השריר והעיצב. סטודנטים ילמדו לפרש נתונים פיזיולוגיים ופרמקולוגיים באמצעות שימוש בחומרים פרמקולוגיים, מוליכים עצביים והורמונים נוירואלים, וירכשו הבנה כללית של תפקוד רצפטורים.
בנוגע לאגוניסטים ואנטגוניסטים, תלמידים יבנו עקומות תגובה למינון ויציגו נתונים בצורה גרפית לצורך ניתוח סטטיסטי. כדי להרדימ את בעל החיים, הניחו סרטן נהר שאורכו 6 עד 10 סנטימטרים על קרח למשך 5 עד 10 דקות. החזיקו את סרטן הנהר המורדם מאחורי הצבתים ביד אחת. חתכו במהירות מארובת העין למרכז הראש בשני הצדדים, ולאחר מכן ערפו את ראשו של סרטן הנהר.
הדם מההכנה יהיה דביק כאשר הוא יתייבש, לכן יש לשטוף את הכלים בסיום התהליך. לאחר מכן, יש לחתוך את הרגליים ואת הצבתים. לאחר מכן, חתכו את סנפי הזנב השמאלי והימני, והשאירו את סנף הזנב המרכזי, תוך חיתוך לאורך הצד הגבי של הבטן עד להגעה למקטע האחרון.
לאחר מכן, גזרו לאורך המקטע האחרון ומטה לצד השני. הסירו את השריון הגבי. הניחו את הסרטן המנוסח בתוך צלחת פטרי המרופדת בנייר סופג.
תמיסת מלח לדגי סרטן נהר (crayfish). כדי לקבע את הדגימה, השתמשו בסיכות ניתוח להצמדתה לפיתרי.
הסר אותם באמצעות פינצטה, תוך הקפדה לא לפגוע במעי. המעי האחורי גלוי כעת לאורך הבטן.
השאירו את תכשיר הסרטן המנוסח בממס המלח למשך כ-10 דקות, כדי שיוכל להתאושש מההלם של הניסוח והחשיפה לממס המלח. עקבו אחר ההתכווצויות הפריסטלטיות האיטיות של המעי האחורי. כעת ניתן לחשב את קצב ההתכווצויות כדי להתחיל.
ספרו את מספר ההתכווצויות המתרחשות ב-30 שניות ורשמו זאת ביומן. רשמו בנוסף את סוג ההתכווצויות המתרחשות והאם הן פריסטלטיות או ספסטיות. ציינו את כיוונן של גלים פריסטלטיים כלשהם.
ספרו את קצב ההתכווצויות בקרבת פיגס הפיטום ובמרכז הבטן, ובדקו האם קיימים הבדלים בקצב בין שני אזורים אלו. הכינו מגוון של תמיסות בדיקה בטמפרטורה זהה לזו של סליין הרחצה. התמיסה הראשונה שתיבדק כאן היא serotonin בריכוז 1 µM שהומס בסליין לסרטנים.
באמצעות פיפטה, הסר את התמיסה המלוחית מחלל הבטן החשופה של הסרטן (crayfish) וטפטף את תמיסת הסרוטונין בריכוז 1 µM ישירות על המעי האחורי. מיד לאחר הוספת התמיסה החדשה, המתן 30 שניות ולאחר מכן ספור את מספר ההתכווצויות באזור הסמוך לפישבון במשך 30 שניות, ואז ספור את מספר ההתכווצויות במשך 30 השניות הבאות במרכז הבטן. רשום מספרים אלו בטבלה וציין גם את סוג ההתכווצויות שהתרחשו.הבא.
שפכו את תמיסת הבדיקה מתוך צלחת ההקלטה ושטפו את המעי האחורי מספר פעמים בתמיסת סלין רגילה לסרטנים. לאחר מכן, שטפו את הדגימה כל 30 שניות במשך חמש דקות. בנקודה זו, ניתן להוסיף את תמיסת הבדיקה הבאה, שבהדגמה זו היא Topamine בריכוז 1 µM.
רשמו את התצפיות כפי שעשיתם קודם לכן וחזרו על תהליך זה עבור שאר תרכובות הבדיקה. בעת שימוש בריכוזים מרובים של אותו חומר, הקפידו להתחיל בריכוז הנמוך ביותר ולהמשיך לעבר ריכוזים גבוהים יותר. המערך למדידת כוח ההתכווצויות של ה-GI כולל מחשב נייד עם תוכנת LabChart 7, את ה-Bridge Pod, את ה-PowerLab 26T ואת המתמר לכוח (force transducer).
לפני שניתן למדוד את עוצמת התכווצויות שרירי מערכת העיכול (GI), יש לבודד את תעלת העיכול. כדי לבצע זאת, הסר באמצעות גזירה את השרירים במקטע הבטני האחרון, נקוב שני סיכות או יותר דרך הקוטיקולה הוונטרלית הרכה משני צדי פי התחת, ולאחר מכן הסר את שאר הבטן, כך שמעי הג后 והפי התחת יישארו מחוברים לחתיכה קטנה של קוטיקולה. יש לחתוך את המעי קרוב לחיבור שבין החזה לבטן.
כעת העבירו את מערכת העיכול לצלחת רדודה בעלת תחתית מצופה ב-sard. קיים כלי דם העובר לאורך ההיבט הגבי של מערכת העיכול. התירו אותו בזהירות ממערכת העיכול.
שפכו תמיסת מלח טרייה לסרטנים על הדגימה. העבירו את המתמר למדידת כוח אל מעל הדגימה. התבוננו מקרוב בפין המודבק לתחתית המתמר למדידת כוח.
לקצה המתחבר למעי יש כיפוף קטן. השתמש בכיפוף הקטן של הסיכה כדי לתפוס את הקצה החתוך של המעי האחורי. לאחר תפיסת המעי האחורי, הזז את הצלחת מעט עד שהמעי האחורי יהיה מתוח.
היה זהיר בשלב זה, שכן המעי צריך להיות מתוח, אך לא הדוק מדי. מתיחה חזקה מדי עלולה לפגוע בשריר. כאשר הצלחת נמצאת במיקום האופטימלי, השתמש בשעווה או בחימר כדי לקבע את הצלחת.
בשלב הבא, הפעילו את התוכנה. כדי להתחיל בהקלטה, פתחו את תוכנת ה-lab chart. סגרו את מרכז הפריסה (welcome center) של ה-lab chart.
עברו להגדרות (setup) בפינה השמאלית העליונה. לחצו על הגדרות הערוץ (channel settings) בפינה השמאלית התחתונה. שנו את הגדרות הערוץ כך שיהיה ערוץ אחד בלבד.
לחצו על אישור בצד ימין של המסך. עברו לערוץ one ופתחו את ה-bridge pod. הגדירו את הטווח להגדרה הרגישה ביותר, במקרה זה 200 microvolts, בחלק העליון של התרשים בפינה הימנית.
הגדירו את מספר המחזורים לשנייה ל-2K. כעת אתם מוכנים להקלטה. לחצו על start כדי לוודא שההגדרות פועלות כראוי.
נגעו קלות בקצה המתמר באמצעות פיפטה. אתם אמורים לראות שינוי בכוח הנרשם בתוכנה. לחצו על stop בתוכנה, לאחר מכן לחצו על start והניחו לתוכנית לרוץ.
במשך כ-20 שניות, לחצו על עצירה (stop) והוסיפו הערה המסומנת כ-saline. חשבו את קצב ההתכווצויות אך ורק על ידי מדידת הזמן מתחילת סטייה אחת לתחילת הבאה, או על ידי ספירת סך הסטייה במשך דקה או שתיים. חשבו את הקצב כמספר התכווצויות לדקה או כמספר התכווצויות לשנייה, בהתאם למהירות שבה הן מתרחשות.
למדידת עוצמת ההתכווצויות, השתמש במדד יחסי כדי להשוות בין התכווצויות בתנאים שונים בתוך הקובץ השמור. הזז את הסמן M לקו הבסיס, ולאחר מכן הזז את הסמן לשיאו של הסטייה ורשום את הערך המופיע בפינה הימנית העליונה של המסך. זהו ערך דלתא המהווה את ההפרש בין M לבין השיא.
שימו לב שיש להשאיר את הסמן ללא תנועה בשיא על מנת למדוד את השינוי. לאחר מכן, הזז את סמן ה-M ואת הסמן לצורת הגל הבאה שמעניינת אתכם וחזרו על המדידה כדי לבחון את השפעת המודולטורים. בהכנה זו, החליפו לאט את תמיסת המלח בתמיסת בדיקה.
במקרה זה, השתמש בסרוטונין בריכוז של one micromolar, והמשך להקליט את קצב ועוצמת ההתכווצויות כבדיקה האחרונה. עבור תכשיר זה, בדוק האם מעכבי gap junction משנים את קצב או עוצמת ההתכווצויות; מעכבי gap junction כוללים one hep ethanol או תמיסת saline שעברה בועבוע ב-carbon dioxide. תרכובות אלו משמשות לבסוף מכיוון שהן עלולות לפגוע בסיבי השריר לאחר חשיפה ממושכת. כדי להשוות את ההשפעה של התרכובות השונות, שרטט את הנתונים על גרף.
שימוש מעניין נוסף של תכשיר זה הוא רישום הכוח המופק על ידי השרירים המעגליים. עם זאת, אם השתמשת במעכבי צמתי פער (gap junction inhibitors) בתכשיר שלך, ייתכן שהמעכבים פגעו בשרירים המעגליים, ובמקרה זה עליך להשתמש בתכשיר מעי אחורי טרי כדי לבחון את השרירים המעגליים. כדי לחשוף את השרירים המעגליים, חתוך את צינור המעי במישור אורכי באמצעות מספריים עדינים.
השתמשו בסיכות עדינות כדי להצמיד צד אחד של הרצועה בבטחה לצלוחית. חברו את הסיכה עם הוו של המתמר לצדו השני של הרצועה. חשפו את הדגימה לאותם תרכובות שנבדקו על השרירים האורכיים; הקשר בין התרכובות שנבדקו לבין מספר וסוג ההתכווצויות מוצג כאן.
ניתן להוביל גרף של מספר ההתכווצויות לעומת זמן עבור תמיסות הסליין, הסרוטונין והגלוטמט. ניתן להוביל גרף של מספר ההתכווצויות לעומת עוצמת ההתכווצויות במילי-וולט עבור תמיסות הסליין, הסרוטונין והגלוטמט. ניתן להכין גרפים אלו הן עבור השרירים האורכיים והן עבור השרירים המעגליים, כדי לבחון האם השרירים האורכיים והמעגליים באזורים השונים של המעי מראים תגובות שונות למודולטורים השונים.
ניתן לחזור על הניסויים שלעיל באזורים שונים מהפיסו ומעלה לאורך הבטן. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להיזהר כדי לא לפגוע במערכת העיכול עם הפינצטה ולא למתוח בעוצמה רבה מדי באמצעות חיישן הכוח בעקבות פרוצדורה זו. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של השריר, כדי לבחון סוגיות אחרות כגון תפקודי תעלות יונים ומודולציות, אשר יכולות לשמש כמודל לרקמות אחרות במודלים חיותיים אחרים.
סקירה כללית
דו"ח זה מציג טכניקות לחקירת הביולוגיה של המעי האחורי של סרטן נחלים, כולל נתיחה ומדידה של פעילות פריסטלטית. המחקר נועד לספק תובנות לגבי האנטומיה, הפיזיולוגיה והוויסות של התכווצויות המעי האחורי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- נוירופיזיולוגיה
- פיזיולוגיה השוואתית
- פרמקולוגיה
רקע
- המעי האחורי של הסרטן (crayfish) משמש כמודל לחקר הבקרה על שרירים ויסרליים.
- הבנת הוויסות של התכווצויות עשויה לסייע במחקרי מחלות קשורות.
- הכנה זו משמשת למטרות מחקר והוראה כאחד.
- סטודנטים לומדים לפרש נתונים פיזיולוגיים באמצעות ניסויים.
מטרת המחקר
- להוראת סטודנטים מתקדמים על ניסויים פיזיולוגיים.
- לבחון את ההשפעות של חומרים פרמקולוגיים על התכווצויות שרירים.
- להגביר את ההבנה של תפקודי קולטנים ופעולת מוליכים עצביים.
שיטות שנutilized
- ניתוח של סרטן המים כדי לחשוף את המעי האחורי.
- מדידת קצבי התכווצות באמצעות מתמר כוח (force transducer).
- החלה של סוכנים פרמקולוגיים שונים כדי להעריך את השפעתם.
- תיעוד וניתוח של נתוני התכווצות לצורך הערכה סטטיסטית.
תוצאות עיקריות
- הדגמה של טכניקות לבידוד ולבדיקה של המעי האחורי.
- זיהוי ההשפעה של תרכובות שונות על עוצמת ההתכווצות.
- הצגת שינויים בקצבי ההתכווצות באזורים שונים של המעי האחורי.
- אספקת מסגרת לבניית עקומות תגובה-מנה.
מסקנות
- מעי התחתון של הסרטן מהווה מודל יעיל לחקר מודולציה של שרירים.
- בדיקות פרמקולוגיות יכולות להשיל את המנגנונים של בקרת התכווצות.
- שיטה זו מגבירה את מעורבות הסטודנטים במחקר פיזיולוגי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח כמותי של התכווצויות המעי האחורי של סרטני נהר מספק פלטפורמה חזקה לבחינת מודולציה נוירו-מוסקולרית ופרמקולוגיה של רצפטורים במערכת ex vivo מבוקרת. מודל זה תומך בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטי עבור תרכובות המשפיעות על תפקוד השריר החלק, עם רלוונטיות ישירה לפיזיולוגיה השוואית ומחקר תרגומי. יכולת השחזור וההתאמה שלו הופכות אותו לבעל ערך לשילוב בתהליכי פיתוח (pipeline) ולהכשרה רב-תחומית במו"פ.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה תפקודית של השפעות מוליכים עצביים ומודולטורים על התכווצות שריר ויסצרלי.
- תומך בסיווג של תתי-סוגי רצפטורים ובפרופיל פרמקולוגי לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- מסייע בבניית עקומות תגובה-מנה לצורך קבלת מידע על מעורבות המטרה (target engagement) ועוצמה (potency).
- מספק מודל השוואתי להערכת מסלולים נוירו-מוסקולריים שמורים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק קריאות סטנדרטיות וכמותיות של כוח ותדירות התכווצות לצורך פיתוח בדיקות (assays).
- מאפשר בדיקה הדירה של תרכובות וריכוזים מרובים בתוך דגימה אחת.
- תומך בניטור חזותי ומכשורי עבור תהליכי סריקה (screening) חסונים.
- מאפשר חזרה מהירה ואופטימיזציה של תנאי הבדיקה עבור יישומים המשכיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מציע מערכת הרלוונטית למחלה לצורך חקר של ויסות קצב הפריסטלטיקה והפרעות נוירו-שריריות.
- מתכתב עם אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי הענקת אפשרות למדידה כמותית של תגובות פיזיולוגיות.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני עבור מטרות של שריר חלק.
- תומך בקבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים המבוססות על תובנות מכניסטיות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
בדיקה זו, המבוצעת ex vivo, מגשרת בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקה מונחית-היפותזה של נוירומודולטורים וליגנדים של קולטנים. היא משתלבת עם תהליכי עבודה החל מתיקוף מטרה ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ותומכת בניתוחים השוואתיים בין תרכובות ותנאים שונים.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות על פעולתם של מוליכים עצביים ומודולטורים במערכת רקמות מבוקרת.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך הערכת תרכובות ותקינה של בדיקות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה סטטיסטית של קצבי התכווצות וכוחות תחת תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים מכניסטיים למודלים רלוונטיים למחלה של פריסטלזה ותפקוד נוירומוסקולרי.
- שימוש חוזר בארגון: משמשה כפלטפורמה רב-פעמית להכשרה, פיתוח בדיקות ומחקרים מכניסטיים בקרב צוותי מו"פ.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות נוירו-שריריות ובבירור מנגנונים פרמקולוגיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות פיזיולוגיות לצורך הדירות וניתנות להרחבה במחקרים בשלבים מוקדמים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ומפחית סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים באמצעות נתונים מכניסטיים חסונים.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון ובקידום של תוכניות למחקר שריר חלק וניומודולציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של נשח, טיפול ברקמות והקלטה פיזיולוגית.
- נחוץ מיכשור של מתמר כוח (force transducer) ותוכנה תואמת לרכישת נתונים.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי בדיקה ושיטות ניתוח נתונים.
- ניתן להתאמה לתרכובות ולריכוזים שונים, אך מוגבל להקשר של רקמה ex vivo.
- מגבלות פוטנציאליות של חיוניות הרקמה מחייבות טיפול זהיר וביצוע ניסויים בזמן.
