פפטידים מהספרייה תצוגה phage לווסת את ביטוי הגנים בתאים mesenchymal ו להגביר Osteogenesis ב פגמים עצם Unicortical

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות רצפים המגבירים את התמיינות תאים מזנכימליים ומעודדים תיקון עצם. השלב הראשוני הוא בידוד הפאג הנקשר לעצם באמצעות biopanning. לאחר מכן, יש לזהות את רצפי הפפטידים הנקשרים לתאים מזנכימליים, וכן לקבוע את השינויים העוקבים בביטוי הגנים.

בצעו ניסויים כדי לקבוע כיצד ניתן להוביל את רצפי הפפטידים לעצם למטרות רגנרטיביות. כשלב סופי, בחנו היסטולוגית את תיקון העצם; שילוב התוצאות יכול לספק תובנות חשובות לגבי מנגנוני התמיינות תאים in vitro ותיקון עצם in vivo. היתרונות של שימוש בטכניקת biopanning עם ספריית phage display הם היכולת שלנו לזהות פפטידים המכוונים לעצם, אשר יכולים לשמש לעידוד התמיינות של תאי מזנכימה ולהגברת תיקון העצם.

בסופו של דבר, רצפי פפטידים אלו עשויים להועיל בשיטות טיפוליות לשיקום עצם ולטיפול באובדן מסה של עצם, כגון אוסטאופניה ואוסטאופורוזיס. בהתבסס על מחקר שבו ULA ו-Pascal הראו שניתן להשתמש ב-biop panning כדי לבודד רצפי פפטידים המכוונים לכלי דם, בחרנו להתאיים שיטה זו לבחינת מנגנונים בעצם. עבור הליך ה-biop panning in vivo, הזרמנו 10^10 plaque performing units של ספריית פפטידי ה-phage display מסוג N-E-B-P-H-D 12 דרך לבו של עכבר מסוג valve C בן 10 שבועות.

לאחר כחמש דקות, בצעו המתנזיה לעכבר, חשפו ו dissection את עצמות הפמור, חתכו את הקצוות והוציאו את מח העצם. שטפו את עצם הפמור השמאלית, הן מבפנים והן מבחוץ, עם PBS 10 פעמים. לאחר מכן, הוסיפו את העצם לחיידקי ER 2 5 3 7.

על מנת להסיר פאג'ים שאינם קשורים, השתמשו ב-2% dried skim milk במזרק עם מחט בכיול 21 כדי לשטוף את התעלה הבינונית של הירך הימנית 10 פעמים. כעת אלוטו את הפאג'ים הקשורים מהתעלה הבינונית באמצעות באפר hydrochloric acid glycine ב-pH 2.2, שנוטרל עם one mo la triss.

כדי להרבות את הפאג', יש להוסיף EIT לחיידקי ER 2 5 3 7 ולגדל למשך 4.5 שעות. העבירו בזהירות את העלונות למבחנות חדשות והשקיפו את הפאג' שלוש פעמים על ידי הוספת פוליאתילן גליקול. תמיסת נתרן כלוריד, דגרו את המבחנות למשך לילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

לבסוף, השביו את המשקע ב-TBS עם 0.02% Sodium azide. בצעו זריעה של הפאג'ים על צלחות כדי לקבוע את מספר יחידות יוצרות הפלאקים (PFU) של ה-EITs שהועשרו. חזרו על הליך ה-bio panning in vivo עבור הפאג'ים שנסחפו ועבור אלו שלא נסחפו ארבע פעמים.

בצע הגברה של מאגר הפאג'ים (pooled phage) בתרביות חיידקים. טהר וכמת את רצף ה-DNA, ה-DNA הסופי של הפאג', באמצעות פריימר 98 המסופק עם ערכת ה-phage display. חשוב לחשב את תדירות הייצוג של רצף ה-DNA של הפאג'.

כעת סנתזו פפטידים הכוללים רצף זרע של glycine glycine glycine sine lysine והרביעו תאי D one, שורת תאים של תאי סטרומה רב-פוטנציאליים ממח העצם של עכבר שפותחה במעבדה שלנו, עד להגעה ל-90% confluence. בצעו Trypsin לתאים וסבבו בצנטריפוגה להשקה ולספירה לצורך צביעת פפטידים; זרעו את התאים על שקופיות עם באריות מצופות ג'לטין וטפחו אותם למשך 24 שעות.

שטפו את התאים ב-PBS וקבעו אותם ב-4%paraldehyde למשך 30 דקות. כעת בצעו דגירה לחסימה עם glycine, ולאחריה עם BSA Aden ו-BBSA. תמיסות חסימה של Biotin.

הוסף 100 micromolar של פפטידים biotinylated L seven ו-R one. המשך בשטיפת התאים שלוש פעמים עם PBS למשך חמש דקות בכל פעם. הוסף מהילול של 1:1000 של LOR strippin, כסה בנייר אלומיניום והדגר במגירה חשוכה למשך 30 דקות.

שטפו את התאים והדביקו את הזכוכיתים עם מדיום קיבוע מסוג vector shield. כעת, נתחו את הפלחיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי 24 שעות לפני הניתוח. השרו את גלילי הספוג הג'ל.

העבירו את גלילי ספוג הג'ל עם פפטיד L seven או R one בריכוז 20 micromolar, או באטנא PBS ללא פפטיד, לצלחות תרבית סטריליות של 12 בארות ושמרו בקירור למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C עד למועד הניתוח. הניחו את תרכובת ספוג הג'ל על קרח עד לשימוש.

באמצעות מקדח פנאומטי תחת שטיפה של תמיסת סלין, צרו פגם אוני-קורטיקלי (uni cortical) מוארך וגדול ברוחב של 3 mm ובאורך של 8 mm. טפלו בפגם בעצם באמצעות ספוגי ג'ל מוכנים על ידי הכנסת כל הפיגומים המשתלים באמצעות טפיחות עדינות. בצעו הרדמה להריגה (Euthanasia) לחולדות ואספו את השוקיים (tibia) בנקודות זמן מוגדרות; בדקו בקפידה את הפגם בעצם וקבעו את השוקיים שנאספו בפורמלין ניטרלי במעובה של 10% לצורך חיתוך בפרפין.

לבסוף, צבעו את כל חתכי הרקמה ב-hematin eosin כדי לסמן את המטריקס העצמי (osteo matrix). Aden המסומן ב-Fluorescein isothiocyanate מאפשר גילוי מיקרוסקופי של קישור פפטידים לתאים שגודלו in vitro. כאן, הפפטידים נקשרים לתאים מזנכימליים בתרבית כדי לקבוע את ההשפעה האוסטאוגנית של פפטידים על תאים.

ניתן לטפל בתאים מזנכימליים בתרבית in vitro בפפטידים לבדיקה כדי לקבוע שינויים במורפולוגיית התאים. לדוגמה, ביום הרביעי, התאים מתחילים להתרכז והצבירים גדלים עם הזמן ליצירת קשריות (nodules). באופן מעניין, נתח עצם שנצבע ב-h ו-e מראה פלואורסצנציה עצמית תחת אור UV.

ניגודיות גדולה זו בין רקמת העצם לרקמות שאינן עצם מקלה על ביצוע ניתוחים המכמתים את נוכחות העצם בחתכים, במטרה לקבוע את מידת תיקון העצם בפגמים שטופלו ב-gelfoam בתוספת פפטיד. בהשוואה ל-gelfoam לבדו, פגמים שמולאו בתוספת פפטיד הראו את הכמות הגדולה ביותר של תיקון קורטיקלי עם הזמן. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להיות שיטתיים ביותר בהזנת הנתונים בשל מספר הדגימות הרב שיצטבר בהכרח לאורך הזמן עד לבחירת קבוצת הפפטידים הסופית.

פיתוחו של מיון ביופטיים (biopanning) in vivo כטכניקה לזיהוי פפטידים המכוונים לעצם, פירושו שכעת עומדות לרשותנו תרופות פוטנציאליות שניתן להשתמש בהן כטיפול לשיקום עצם ולמניעת אובדן מסה גרמית. אחד המנגנונים העומדים בבסיס שיקום העצם מעורב גם באובדן מסה גרמית. הבנה מעמיקה יותר של מנגנונים אלו, ופיתוח כלים שניתן להשתמש בהם לטיפול בהפרעות כגון איחוי שברים מושהה ואוסטאופורוזיס, יסייעו בשיפור הטיפולים שניתן לתכנן למטרות רפואיות.