הקלטות Postsynaptic ב דנדריטים מביא פנייה שבלול תאים שיער פנימית: שחרור Multivesicular ניטור ב סינפסה סרט

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקליט פעילות פוסט-סינפטית בסינפסות אפרנטיות של תאי שערה פנימיים. דבר זה מושג תחילה על ידי חשיפת האפיתל החושי של שבלול שהוצא לאחרונה מחולדה שעברה דקפיטציה. השלב השני של הפרוצדורה הוא מיקום החלק האפיקלי שהוצא על גבי כיסוי זכוכית (cover slip) שעבר התאמה, והעברתו לתא ההקלטה.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא לאתר ולהגיע לסיב תחושתי (afferent baton) עם אלקטרודת רישום. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ליצור אטימה הדוקה על ממברנת הסיב התחושתי ואז לפרוץ אותה, כדי לבסס את תצורת התא השלם (whole cell configuration) של טכניקת ה-patch clamp. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות התרחשויות או פוטנציאלים פוסט-סינפטיים מסינפסת סרט (ribbon synapse) בודדת באמצעות אלקטרופיזיולוגיית patch clamp בתצורת תא שלם.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון שהדיסקציה וההכנה של רקמת השבלול (cochlea) קשות ללמידה, והסיבים האפרנטיים הקטנים קשים לזיהוי ולגישה. לפני תחילת הדיסקציה, הכינו כיסוי זכוכית (cover slip) מותאם שיחזיק את הדגימה במקומה במהלך ההקלטות. בעזרת כיסוי זכוכית עגול בקוטר של 8 עד 12 מילימטרים, מרחו טיפה של Sylgard במצב חצי-מ cured לכיוון קצה הכיסוי.

הניחו את הקצה העבה של סיכת חרקים דקה על לוכית הכיסוי. החזיקו את סיכת החרקים בחוזקה כנגד הזכוכית. בעזרת פינצטה, חממו את מגן הסף כנגד סליל מחומם כדי לקבע אותו.

הכינו 10 עד 20 מיקרו-אלקטרודות כפי שמתואר בטקסט המלווה. לאחר ליטוש באש באמצעות מיקרו-פורג' (micro forge), קוטר הקצה החיצוני של המיקרו-אלקטרודה צריך להיות כמיקרון אחד. העובי הסופי של דופן הפיפטה הוא כשליש מיקרומטר, לאחר הרדמה ועריפת ראש של חולדה בת שלושה שבועות.

התחילו את הנתיחה בהסרת העור, לאחר מכן נתחו את הראש והסירה את המוח. כדי לחשוף את עצם הרקה, הסירו את שתי עצמות הרקה. הניחו כל עצם רקה בצלחת נתיחה נקייה המכילה תמיסה חוץ-תאית סטנדרטית. השלב הבא הוא להסיר את העצם העוטפת את עצם הרקה, כדי לחשוף את השבלול.

החזיקו את עצם הרקה בבטחה בבסיסה באמצעות פינצטה. זהו את החלון העגול, החלון הביצוי ואת השבלול. כוון את השבלול כך שהחלון הביצוי והצד הספירלי של השבלול פונים כלפי מעלה.

הסיר עצם עודפת מסביב לשבלול (cochlea). השתמש בזוג שני של פינצטות עדינות כדי להסיר רסיסי עצם ישירות מהשבלול, והתחל באזור השקוף יותר משאר העצם. באזור זה העצם דקה יותר וקל יותר להסירה.

המשיכו להסיר את העצם מסביב לסליל האפקלי (apical coil). השתמשו במספרי מיקרו-דיסקציה כדי לחתוך דרך המודיוס (modiolus) מתחת לסיבוב האפקלי. לאחר מכן, נתקו את הסיבוב האפקלי מהסיבובים התחתונים של השבלול (cochlea).

יש להקפיד להגן על הסליל האפקלי (apical coil). אין למשוך או למתוח אותו. לבסוף, הוצאו את הסיבוב האפקלי מהשבלול (cochlea) תוך הקפדה על מניעת קריעה מרובה של הרקמה.

השתמשו בפינצטה עדינה כדי להסיר את שארית העצם. השלב הבא הוא הסרת ה-STR of oculis והממברנה הטייאלית (tial membrane). הסירו בזהירות את ה-STR of oculis, פס הרקמה המבריק הממוקם מחוץ לאזור תאי השערה.

הקפידו להימנע מהסרה של תאי השערה החושיים, שעלולים להיפרד בקלות יחד עם ה-STR של ה-oculis. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה עדינה כדי להפריד את קרומי ה-tial. הקרום המבריק והחצי-שקוף שנמצא מעל תאי השערה החושיים; כעת גזרו רקמות ועצם עודפות והשטיחו את הדגימה באמצעות הפינצטה.

דבר זה נחוץ כדי שניתן יהיה להניח את הרקמה באופן אחיד תחת סיכה. שלב הדיסקציה הסתיים כעת. הנח את הדגימה תחת הסיכה על לוכית הכיסוי שהוכנה, תוך הקפדה למקם את הסיכה הרחק מתאי השערה לאחר סיום הדיסקציה.

השתמשו בפינצטה כדי להעביר את הדגימה לתא ההקלטה, תוך שמירה על טיפה של נוזל חוץ-תאי על לביבת הזכוכית (cover slip) המחזיקה את רקמת השבלול, והתחילו מיד בפרפוזיה עם תמיסה חוץ-תאית. כדי להבטיח הישרדות טובה יותר של הדגימה, השתמשו בעדשה אובייקטיבית 10x של המיקרוסקופ או בעדשת DIC עם טבילת מים 40x. כדי לאתר את הדגימה, כוונו אותה כך שאלקטרודות ההקלטה יוכלו לגשת לתאי השערה הפנימיים בזווית ישרה לדפנות הצדיות שלהם.

אם הנראות של האזור הבזאלי של תאי השערה הפנימיים מוגבלת מכיוון שהדגימה מקופלת, השתמש באלקטרודת רישום כדי לדחוף את הקצה החיצוני של הדגימה מטה אל מול לבישת הזכוכית. יש להקפיד להימנע מלחיצה ישירה על תאי השערה הפנימיים עצמם. בהכנה זו, האלקטרודה העליונה מחזיקה את הקצה החיצוני של הדגימה למטה, והאלקטרודה התחתונה מסמנת את המיקום של ה-afferent batons.

לצורך ייחוס, מצלמת ה-NC 70 Nuv Con מציגה את התמונה המוגדלת של ה-Forex על המסך כדי להעריך האם הרקמה באזור תאי השערה הפנימיים בריאה. אתר את צמורי השערה כנקודת ייחוס ובצע פוקוס כלפי מטה כדי למצוא את הגרעינים. בצע פוקוס נוסף כלפי מטה לכיוון בסיס תאי השערה הפנימיים עם הסיומות האפרונטיות שלהם, ולאחר מכן פוקוס חזרה למעלה עד להגעה לגובה הגרעינים על המסך.

כעת אתרו את הבטונים האפרנטיים (afferent batons) סביב בסיסן של תאי השערה הפנימיים. הבטונים הם כדוריים או אליפסואידיים, בקוטר של כ-one micron, והם בהירים בצבעם בעלי מראה מבריק. ניתן למצוא אותם באמצעות מיקוד מעלה ומטה.

השלב הבא הוא לפנות נתיב לסיבים האפרנטיים (afferent fibers) באמצעות אלקטרודת רישום בעלת קצה של מיקרון אחד הממולא בתמיסה תוך-תאית. הפעל לחץ חיובי והשתמש במיקרו-מניפולטור כדי להניע את האלקטרודה לעבר הדגימה. השתמש באלקטרודה זו כדי לבצע חתך בדגימה בגובה בסיס תאי השערה הפנימיים.

דחפו את האלקטרודה בין השכבה הדקה של התאים התומכים לבין תאי השערה הפנימיים באמצעות לחץ חיובי כדי ליצור נתיב גישה לאזור בבסיס תאי השערה הפנימיים. הוציאו בזהירות את האלקטרודה והחליפו אותה באלקטרודה חדשה עם קצה בקוטר מיקרון אחד המלא בתמיסה תוך-תאית. תוך שימוש בלחץ חיובי לשמירה על קצה אלקטרודה נקי, הניעו את אלקטרודת ההקלטה דרך חור הגישה, מסביב לתאים תומכים סמוכים, לעבר ה-afferent baton.

יש לוודא שקצה האלקטרודה נמצא ישירות מול ה-afferent bouton; ה-boutons מציעים התנגדות רבה יותר לתנועת הפ pipette מאשר התאים התומכים וממברנת תאי השערה הפנימיים. ניתן להרגיש הבדל זה בעת הזזת ה-pipette; יש להניע את ה-pipette מעלה ומטה וללחוץ כדי לוודא שה-bouton זז. דבר זה מעיד על כך שקצה ה-pipette וה-bouton נמצאים באותו מישור מיקוד, כאשר האלקטרודה לחוצה כנגד ה-afferent bouton. במקביל, יש לשחרר את הלחץ החיובי ולהפעיל יניקה כדי ליצור giga ohm seal.

בצעו משיכות ואקום קצרות ועדינות כדי לקרוע את הממברנה בתוך האלקטרודה ולהשיג רישום של תא שלם (whole cell recording). אם התא שנבחר לתיקוע (patched) הוא סיב אפרנטי מסוג baton, נצפו תופעות קיבוליות חולפות (capacitive transients) קטנות במצב רישום של תא שלם. איור זה מציג תגובה חולפת טיפוסית שנרשמה מסיב אפרנטי.

התחל בהקלטת הפעילות הסינפטית. אם הסיב האפרנטי אינו מפגין פעילות ספונטנית, גרם לדפולריזציה של תא השערה באמצעות יישום של תמיסה חוץ-תאית בעלת ריכוז אשלגן גבוה יותר. איור זה מציג קשרי זרם-מתח טיפוסיים עבור סיבי AFF משמאל ותאי שערה פנימיים מימין.

קשרי זרם-מתח נרשמו בפוטנציאל החזקה של 84- millivolts עם מדרגות מתח מ-124- millivolts עד 36+ millivolts במרווחים של 10 millivolt. המתחים מוצגים מימין לחלק מהעקבות, תוך התמקדות בקשרי זרם-מתח מסיב אפרנטי. שימו לב כי אירועים פוסט-סינפטיים מעוררים או EPCs נוכחים במהלך מרבית מדרגות המתח.

ה-EPCs הפכו לחיוביים בערך ב-6 millivolts חיוביים. הקלטה זו בוצעה בנוכחות של tetrodotoxin כדי לחסום זרמי נתרן תלוי-מתח; ללא החוסם, היו מופיעים בהקלטה גם זרמי נתרן פנימה בעלי הפעלה מהירה, מה שהיה מזהה את ההקלטה כהקלטה של סיב אפרנטי. שימו לב לזרם הפנימה בעל ההפעלה האיטית במתחים היפר-פולריים.

זרם זה אינו קיים בתאי שיער פנימיים או בתאי תמיכה, והוא מהווה אינדיקציה טובה לכך שההקלטה היא מסיב אפרנטי. הקלטות אלו מראות את יחסי המתח-זרם של תא שיער פנימי. החץ מצביע על זרמי אשלגן יוצאיים עם הפעלה מהירה בפוטנציאלים חיוביים.

לאחר מכן מופיעים זרמי אשלגן של מיישרים מושהים (delayed rectifier potassium currents) עקב קוטר פיפטה צר והתנגדות גישה גבוהה. זרמי תאי השערה הפנימיים המוצגים כאן קטנים מהמצופה כדי להשיג הקלטות מדויקות של זרמי תאי שערה פנימיים. יש להשתמש בפיפטות בעלות התנגדויות גישה נמוכות יותר.

עם זאת, ההקלטות המוצגות כאן מדגימות כי ניתן להבחין בבירור בין יחסי זרם-מתח של תאי שיער פנימיים לבין אלה של סיבים אפרנטיים. איור זה מציג זרמים סינפטיים שהוקלטו מסיב אפרנטי. שימו לב לגודל ולצורה המשתנים של ה-EPCs.

ההקלטות בוצעו בטמפרטורת החדר עם יישום של tetra toin כדי לחסום את זרמי הנתרן תלויי-מתח. איור זה מציג הקלטות סימולטניות מתא שיער פנימי ומבטון אפרנטי (afferent baton) במגע עמו. מדרגת מתח שימשה לדפולריזציה של תא השיער הפנימי, ובתגובה נרשמו זרמי סידן פנימה מתא השיער הפנימי; זרימת הסידן פנימה גורמת לשחרור מוליכים עצביים ולהפעלת EPCs בבטון האפרנטי.

שימו לב לדיכוי הסינפטי המופיע במהלך דפולריזציה של 50 מילישניות של תאי שיער פנימיים בעת ביצוע פרוצדורה זו. חשוב לזכור לנהוג בזהירות בעת הדיסקציה וההכנה של רקמת השבלול, ולהישאר סבלניים ואופטימיים בעת הניסיון להקליט מטרמינלים אפרנטיים.