Patch-clamp מדידות קיבול ו Ca 2 + הדמיה על מסופי עצב יחיד ב Slices רשתית
19 בינואר 2012
כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת אגר, מוטבע פרוסות רשתית המתאימים electrophysiology ו Ca2 + הדמיה. שיטה זו מאפשרת ללמוד סרט מסוג הסינפסות microcircuits הרשתית באמצעות תיקון ישיר, מהדק הקלטות של אחד מסופי העצב presynaptic.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין פרוסות רשתית מוטמעות באגר למשם חקר המעגלים הזעירים הממוקמים בקצוות העצביים הפרסינפטיים של תאי ביפולר. דבר זה מושג תחילה על ידי השגת הרשתית מעין של דג זהב שהותאם לחושך, וחיתוך חתיכה מלבנית קטנה מרשתית זו. חתיכת הרשתית טובעת לאחר מכן בתמיסת אגר שקופה בעלת נקודת התכה נמוכה, אשר מוקשחת לאחר מכן בתמיסת חיתוך קרה ואיכותית.
השלב הבא הוא לחתוך את גוש האגר המוצק המכיל את פיסת הרשתית המלבנית באמצעות ויברטור. השלב האחרון הוא להדגים, לזהות ולבצע טלאי (patch). קבעו בעזרת מלקחיים סיומת של תאי עצב בביפולריים.
בסופו של דבר, התוצאות מראות את זרם הסידן הפרה-סינפטי ואת האקסוציטוזה הפיזית הסינפטית באמצעות מדידות קיבול ממברנה של טרמינלים של תאי בנשתיים (bipolar cells) מפורסמים ושלמים. שלום, שמי האן קים. אני פוסט-דוקטורנט במעבדת PCO במכון ברהם.
היום אציג את הכנת פרוסות מוטמעות של רשתית פנים קרה בשיטת AGA, ואדגים מדידת קיבול (capacitance) בשיטת patch clamp בצינור בודד. כדי להתחיל בהליך זה, יש לחלק כל עינ של דג זהב לשניים על ידי גזירה אחידה מסביב לחלק הקדמי של העין באמצעות מספרי קפיץ. לאחר מכן, יש להניח את כוסות העין בתמיסת פרוסות מקוררת ללא סידן.
במידת הצורך, הסירו את העדשה בעזרת פינצטה. לאחר מכן, הסירו את אפיתל הפיגמנט הצמוד לרשתית על ידי קילוף הרשתית מגביע העין בעזרת פינצטה עדינה בעלת קצוות בזווית של 45 מעלות. לאחר מכן, חתכו את העצב האופטי בעזרת פינצטה עדינה או מספרי קפיץ.
לאחר מכן, בצעו שאיבה באמצעות פפיפט פסטה משופר או פפיפט העברה בעל טיפ גדול. כדי להסיר את הרשתית, הסירו בעדינות את שארית אפיתל הפיגמנט ההדבקה לרשתית. פני השטח של הרשתית הנקייה והבריאה צריכים להיראות חלקים.
לאחר מכן, טפלו ברשתית המבודדת ב-IDE בריכוז של כ-0.03% למשך 15 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. לצורך הסרת נוזל הזגוגית, שימו לב כי יש לבצע את הפעולה בתאורה חלשה. בשלב הבא, גזרו פיסה מלבנית של רשתית בגודל של כ-שני על שני מילימטרים, הכוללת את מלוא עובי הרשתית, על ידי הסרת הקצוות המעוקלים באמצעות להב תער.
לאחר מכן, העבירו את פיסת הרשתית למכל කුטן המלא בתמיסת אגר ותנסו למזער את כמות התמיסה מסביב לרשתית בעת הנחתה לתוך האגר הנוזלי. לאחר מכן, טבלו את הרשתית עם האגר ישירות בתמיסת הפרוסות הקרה בקרח כדי להקשיח את האגר. בשלב הבא, חתכו את גוש האגר המוצק המכיל את פיסת הרשתית המלבנית לקובייה בגודל של 1X1X1 סנטימטר.
הדביקו את הבלוק לפני השטח של לוח החיתוך בתא ה-preco slice. לאחר מכן, חתכו את הבלוק לפרוסות בעובי של 200 עד 250 מיקרון בתמיסת חיתוך קרה (ice cold). באמצעות vibratome, ניתן להפיק סך של חמש עד 10 פרוסות, אשר נשארות חיוניות למשך כחמש עד שש שעות.
לאחר מכן, העבירו את אחת הפרוסות לתא ההקלטה. הניחו על גבי הפרוסה מסגרת פלטינה בצורת U עם רשת של חוטי ניילון. בצעו פרפוזיה רציפה של הפרוסה בקצב של 1-2 milliliters per minute של תמיסת הקלטה המאווררת בקרבוגן.
בשלב זה, השתמש במזרק עם קצה מסנן של 0.2 מיקרון כדי למלא את פיפטת ה-patch מזכוכית בתמיסה פנימית עד למפלס של סנטימטר אחד עד שניים מגב הפיפטה. לאחר מכן, הסר בועות אוויר מהקצה. own את הפיפטה במחזיק.
הפעיל לחץ חיובי על הפיפטה והזז אותה לכיוון הטרמינל המיועד באמצעות מיקרו-מניפולטור, תוך כדי הנעת הקצה כלפי מטה דרך הפרוסה. הנע את הפיפטה בתנועת סריקה צידית כדי להבטיח שהפרוסה אינה נמשכת יחד עם הקצה. לאחר מכן, הנע את קצה הפיפטה מסביב לטרמינל כדי לנקות את פני השטח של הממברנה.
דחפו את הקצה כלפי מטה כנגד שולי התרמיה כדי ליצור שקע ושחררו את הלחץ החיובי. אם לא נוצר אטום בדרגת giga ohm באופן מיידי, הפעילו לחץ שלילי קל על הפיפטה. ברגע שנוצר אטום בדרגת giga ohm, העבירו את מגבר ה-patch clamp מדגם E PC nine למצב הקלטה של onsell ושנו את פוטנציאל ההחזקה ל-60- או 70- millivolts.
בצע את תיקון הקיבול המהיר (fast capacitance correction) והמתן עד שהאטימה תתייצב בין 5 ל-10 giga ohms. לאחר מכן, פחץ את הממברנה באמצעות שאיבה חזקה ועדינה, כדי להקים תצורת הקלטה של התא השלם (whole cell recording).
ניתן להשתמש גם ביניקה באמצעות הפה במקום במזרק. לאחר שהוקמה תצורת תא שלם על קצה אלקטרודה MB מ atomized, החילו דפולריזציה מדורגת למשך 200 millisecond מ-70- עד אפס millivolts. זכרו שגל סינוס בתדר של two kilohertz מוחל במצב voltage clamp לפני ואחרי דפולריזציה זו. על מנת למדוד את קיבול הממברנה, הדפולריזציה מאפשרת מדידה ישירה של זרמי סידן פנימה המופעלים על ידי פתיחה של תעלות סידן מסוג L תלויות-מתח, תוך שימוש בתמיסה פנימית מבוססת cesium.
במקביל, ניתן לנטר את קפיצת הקיבול (capacitance jump) הנגרמת על ידי אקסוציטוזה תלויית סידן של שלפוחיות סינפטיות, המגדילה את שטח הפנים של הממברנה. אם תבצעו פאץ' (patch) לתא דו-קוטבי (bipolar cell) שלם של ה-MB באמצעות פיפט על הסוף הסינפטי, לא ייראו זרמי סידן מובחנים בשל זרמי הדלפה גדולים הנובעים מצימוד של מנקי-פער (gap junction) בתאי ה-MB הדו-קוטביים. מה שרואים הוא זרם דמוי-הדלפה גדול החוצה.
עם זאת, עדיין ניתן לנטר את הקפיצה בקיבול (capacitance jump) באמצעות גירוי סינוסואידלי בתדר גבוה שמופעל לפני ואחרי שלב הדפולריזציה המוצג. להלן דוגמאות של I-R-D-I-C, תמונות של קצות תאי M bipolar. קצוות תקינים נוטים להיראות אליפטיים כפי שמוצג ב-A וב-B, בעוד ש-C מראה קצה מעורב, שנראה עגול ומעגלי.
ניתן להשתמש בשיטת מילוי הצבע גם כדי לסווג את קצות התאים. להלן דוגמאות לתמונות פלואורסצנציה של קצות תאי MBI דו-קוטביים עם אקסון שלם ב-D, אקסון חתוך חלקית ב-e ואקסון שהוסר לחלוטין ב-F. הטרייתם (teria) מסומנת על ידי החצים הכחולים. כאן מוצגות המדידות הישירות של אותות דימות סידן, אקסוציטוזה ומשוב מעכב.
בטרמינל של תא דו-קוטבי ב-MB, ריכוז סידן עולה וארעי בטלריה של טרמינל MB הופעל על ידי דפולריזציה של מדרגת voltage clamp; ניתן לראות את תמונת הפלואורסצנציה המתאימה של טלריה ה-MB בסעיף B. דוגמאות לדיכוי סינפטי לטווח קצר של שחרור מתווכי עצב מוצגות בסעיף C. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לצמצם את כמות התמיסה סביב הרשתית בעת הצבתה באגר של הערכה. הדבר ישפר את ההיצמדות של ה-Latinized לבלוק האגר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול להכנת פרוסות רשתית המוטמעות באגאר, המתאימות לחקר מיקרו-מעגלים בעמדי עצב של תאי בופולר פרה-סינפטיים. השיטה מאפשרת הקלטות patch-clamp ישירות של עמדי עצב פרה-סינפטיים בודדים, ובכך מקלה על חקירת סינפסות מסוג ribbon במעגלים של הרשתית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- טכניקות דימות
רקע
- מעגלים זעירים ברשתית ממלאים תפקיד מכריע בעיבוד חזותי.
- הבנת מנגנונים סינפטיים חיונית למחקר במדעי המוח.
- טמיה באגר מספקת תמיכה מבנית עבור פרוסות דקות.
- טכניקות Patch-clamp מאפשרות מדידות חשמליות מדויקות.
מטרת המחקר
- להכנת פרוסות רשתית לבדיקה אלקטרופיזיולוגית.
- לחקר התפקוד של סינפסות מסוג סרט (ribbon-type synapses).
- לשיפור ההבנה של הדינמיקה במעגלים זעירים ברשתית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השגת רשתית מעיני דג זהב שהותם בחושך.
- הטמעה של חתיכות רשתית באגאר בעל נקודת התכה נמוכה.
- חיתוך של גוש האגאר המוצק באמצעות ויברטום.
- ויזואליזציה וביצוע patch-clamp של סופי העצבים של תאי דו-קוטביים.
תוצאות עיקריות
- הכנה מוצלחת של פרוסות רשתית מוטמעות באגר.
- הוכחת היתכנות של הקלטות patch-clamp ישירות.
- זיהוי סינפסות מסוג סרט (ribbon-type synapses) במעגלי הרשתית.
- השיטה מאפשרת מחקר מפורט של התפקוד הסינפטי.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר מעגלים מיקרו-וסקולריים ברשתית.
- הקלטות patch-clamp ישירות יכולות לחשוף דינמיקה סינפטית.
- גישה זו עשויה לקדם את המחקר במדעי העצב של הראייה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פרוטוקול זה מאפשר חקירה אלקטרופיזיולוגית ואופטית ישירה של סופי עצבים פרה-סינפטיים במעגלים זעירים של הרשתית, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכניסטית של יעדים סינפטיים המעורבים בעיבוד אותות חזותיים. על ידי כימות אקסוציטוזה תלוית סידן ומשוב עיקבי בסינפסות מסוג ribbon, הוא מספק ביטחון ניבוי בתיקוף יעדים עבור תוכניות גילוי במדעי העצבים. גישה זו נותנת מענה לנקודת הכרעה מרכזית בשלב הגילוי המוקדם, שבה תיקוף תפקודי של מנגנונים פרה-סינפטיים מנחה החלטות go/no-go לפיתוח מודולטורים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות מדידה של זרמי סידן פרה-סינפטיים ושינויים בקיבולות הקשורים לאקסוציטוזה של שלפוחיות.
- ערך תפעולי: מאפשר הפחתת סיכונים ביולוגיים של תפקוד סינפסות מסוג ribbon באמצעות גישה ישירה לקצות עצביים מבודדים.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי כימות פלסטיות לטווח קצר של שחרור מתווכיt עצביים מעוררים ומעכבים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: הכנה של מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקת תרכובות בהמשך, על ידי ייצוב פרוסות רשתית עבור אלקטרופיזיולוגיה ודימיון.
- פלטים כמותיים: יצירת קריאות הדירות של קיבול ממברנה ודימיון סידן, המאפשרות השוואת השפעות של תרכובות.
- מדרגיות: תמיכה בשימוש חוזר בפלטפורמה על פני מספר טרמינלים לכל פרוסה, דבר המשפר את התפוקה לחקירת מנגנונים סינפטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: תואם למודלים של מחלה נוירודגנרטיבית של הרשתית שבה תפקוד סינפטי לקוי קודם לאובדן תאים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לאישור פרה-קליני על ידי שימור ארכיטקטורת המעגל המיקרוסקופי הטבעית בפסנאות טבועות באגר.
- קידום מותאם סיכון: מספק מידע לקבלת החלטות לגבי יעילות של מודולטורים על ידי לכידה של דינמיקת עיכוב משוב הדדי מתאי אמקרין.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימה
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאישור המטרה ועד לזיהוי מובילים (leads), באמצעות אספקת קריאות תפקודיות של פעילות פרה-סינפטית במערכת הרלוונטית למחלה.
- ביולוגיה של התגליות: תומכת בבדיקת השערות לגבי מנגנונים פרה-סינפטיים באמצעות מדידה ישירה של זרימת סידן ואקסוציטוזה.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות הכנה סטנדרטית של פרוסות וגישה יציבה לטרמינלים לצורך הקלטות חוזרות.
- אנליטיקה: מאפשרת השוואה כמותית של תנאים תוך שימוש בקפיצות קיבול ממברנה ובדימיון סידן כמשתנים תלויים.
- מחקר תרגומי: שומרת על רציפות פרה-קלינית על ידי שימור מיקרו-מעגלים סינפטיים בפרוסות רשתית למחקר אורך.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת הניתנת לשימוש חוזר לחקירת תפקוד סינפטי על פני מספר מפגשים ניסיוניים לכל הכנה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באישור המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית באותות פרה-סינפטיים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות נהלי הטמעה באגר וחיתוך סטנדרטיים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) על ידי אספקת נתונים כמותיים על פלסטיות סינפטית ועכבה במשוב.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד עדיפויות מותאם סיכון של תרכובות המודולות תעלות סידן פרה-סינפטיות או את מנגנון שחרור הוסיקולות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטכניקות של patch-clamp electrophysiology ודימוי סידן.
- תלוי בציוד חיתוך רטט (vibratory slicing) ובאגר בעל נקודת התכה נמוכה לייצוב הרקמה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת איכות פרוסות עקבית וזיהוי טרמינלים.
- כולל שיקולי התאמה בעת מעבר למערכות מודל אחרות בעלות ארכיטקטורות סינפטיות שונות.
- מוגבל על ידי חלון החיוניות של הרקמה, הנמשך 5–6 שעות לאחר החיתוך, דבר המחייב ביצוע של הניסוי באותו היום.
