מסך התפוקה גבוהה עבור Biomining פעילות cellulase מספריות Metagenomic

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לזהות שיבוטים המבטאים cellulase מספרייה מטגנומית. דבר זה מושג תחילה על ידי שכפול של ספרייה מטגנומית שהוכנה בעבר באמצעות רובוט, לאחר דגירה של הספרייה המשוכפלת בטמפרטורה של 37 °C למשך 24 שעות. הצמיחה של שיבוטי ה-e coli נמדדת, ולאחר מכן מתווספים לספרייה המשוכפלת חומר לליזיס, באפר ותסריט (substrate).

בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות פעילות של cellulase באמצעות מדידות ספיגה קולורימטריות בעזרת קורא לוחות. שלום, אני קית' מהמעבדה של סטיבן הלאם במחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה באוניברסיטת הבריטיש קולומביה. היום נראה לכם פרוצדורה לסריקה תפקודית בהספק גבוה של ספריות מטגנומיות.

אנו משתמשים בנוהל זה במעבדה שלנו כדי לחקור פעילות cellulase ביומינית מספריות מטגנומיות. אם כן, נתחיל. לפני תחילת הפרוטוקול, הכינו ספרייה מטגנומית המאוחסנת בפורמט של פלטת 384 בארות.

במחקר זה נעשה שימוש בוקטור ה-SMID מסוג PCC one copy control בשילוב עם תאי e coli מסוג Farge T one resistant TRANSFECT max EPI 300 T one resistant כמארח לספרייה. כדי להתחיל את ההליך, הוציאו את הפלטות המכילות את הספרייה מטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס והמיסו אותן בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-20 דקות. במקביל, השתמשו במערכת עיקור באור UV של ה-QIX two כדי לעקר את הרובוט למשך 15 דקות. הגדירו את ה-Q fill three לפי הוראות היצרן, כאשר בקבוק המדיית מחובר לסבון (manifold) באמצעות הצינור הסטרילי המתוכנת.

מלאו את ה-Q fill three בכמות המתאימה של מצע והגדירו אותו למילוי נפח של 45 µL. בכל באר, נקו את האוויר מהצינור והמניפולטור באמצעות תכונת הניקוז (purge) של הרובוט עד שניתן יהיה לראות את המצע. בכל פין של המניפולטור, מלאו את מספר הפלטות הרצוי במצע LB באמצעות ה-Q fill three.

מילוי כל פלטה אורך כ-20 שניות. לאחר מכן, טענו את פלטות הספריה ואת הפלטות הרקנות לאזורים המתאימים של ה-Q picks. הפעילו את הרובוט למילוי אמבטיות הניקוי בריאגנטים המתאימים.

2% micro 90 באמית השטיפה האחורית, מים מזוקקים שעברו אוטוקלאב באמית השטיפה האמצעית, ו-80% ethanol באמית השטיפה הקדמית. באמצעות תוכנית השכפול של ה-qix two, בחרו את הראש המתאים וכן את המספר והסוגים של פלטות המקור והיעד. הגדירו בנוסף את הראש לבצע ניקוי בין השכפולים.

בדרך כלל שישה מחזורים בכל אמבטיה הם מספיקים. קיבולת המכשיר היא 10 פלטות בו-זמנית. הגדירו את המכשיר להפעלה.

תהליך השכפול ייקח כ-15 דקות. קיבולת מלאה עם ראש בעל 384 פינים. לאחר שכפול הפלטות, גדלו את הפלטות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 24 שעות בתיבת לחות.

זמן הדגירה הממושך נחוץ כיוון שמספר עותקים גבוה של smid מונחה באמצעות הוספת arabinose. בינתיים, נקו את הרובוט Q fill three כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר הדגירה, הוציאו את הפלטות מהדגירה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.

הניחו את המכסים בצד והניחו את הפלטות על פלטפורמת טעינת המחסנית המסופקת עם ה-rapid stack. הקפידו לעקוב אחר סדר הפלטות, מכיוון שהתוכנה אינה עושה זאת. הפלטות שבתחתית הערימה הן שיקראו.

ראשית, הוצאו מגזין אחד מהערמה המהירה. ודאו שהוא ריק והניחו אותו על ערמת הפלטות המיועדת לקריאה. תפסו את המגזין בידית, והפלטה אמורה להיטען לתוך המגזין.

הכנס את המגזין למערכת הערימה המהירה (rapid stack) בכיוון הנכון. פתח את תוכנית הסריקה במחשב המחובר. בחר ב-new session ותן לה שם מתאים.

בחרו בלוחית 384 בארות בעלת תחתית שטוחה (flat bottom 384 Well plate) כלוחית. הקלידו באזור פריסת הלוחית. בחרו בכפתור ה-wizard והשתמשו בו כדי להוסיף 384 דגימות לא ידועות (unknowns) ללוחית.

באזור הפרוטוקול, בחרו באפשרות well loop והזינו 384 wells. סמל של well loop יופיע בעץ הזרימה בצד שמאל של המסך. בחרו בסמל ולחצו כדי להוסיף photometric measurement.

הגדירו אותו לקריאה ב-600 nanometers. שמרו את הפרוטוקול תחת שם ייחודי וסגרו את תוכנת הסריקה. לאחר מכן, פתחו את תוכנת polara RS.

בעמוד הראשי מופיעה טבלה המפרטת את המכשירים המחוברים למערכת ה-rapid stack; תחת הכותרת VARI scan, לחצו על אפשרות ה-run session. לאחר מכן אמור להופיע חלון הבדיקה עם תרשים זרימה במרכזו. בחרו בפריט run session, ולאחר מכן חפשו את שם הסריקה השמורה.

יש להפעיל אותו מחדש בתפריט הנפתח המופיע בצד ימין של המסך. לאחר בחירת הפרוטוקול, לחץ על run. בשלב זה יופיע חלון שיבקש לציין באיזה מגזין להשתמש כמקור ואיזה מגזין ריק.

התיבה התחתונה על המסך תואמת למגזין הקדמי. ודאו שגם ה-rapid stack וגם ה-Vario scan דלוקים, ולחצו על start. ה-rapid stack יטען באופן אוטומטי את הפלטות לתוך קורא הפלטות, מה שיאפשר מדידות רציפות של הפלטות.

עקבו אחר טעינת הפלטה הראשונה לתוך ה-Vario scan כדי לוודא יישור נכון של המכשירים לקריאה. סריקת 25 פלטות אורכת כ-50 דקות. עם סיום סריקת ה-Barrios, הוציאו את המגזין המלא והניחו אותו על פלטפורמת טעינת המגזינים.

הרימו את המלבן החיצוני של הפלטפורמה והמגזין אמור להחליק החוצה, כך שהפלטות יישארו עומדות בערימה במרכז. לבסוף, החזירו את המכסים על הפלטות עבור סריקה מבוססת תמיסה. עבור בדיקת פעילות צלולוז תחילה, הכינו את תערובת המבחן באמצעות תמיסת מנתק (lysis) ריכוזית פי 10 שהוכנה מראש.

ערבב עם באפר פוטסיום אצטט 50 millimolar ב-pH 5.5 כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, הכן תמיסת סטוק בריכוז של עד 75 milligrams per milliliter של סובסטרט כרומוגני DIPHENYL או DNP להשמדת תאים ב-DMSO, תוך וידוא שהסובסטרט מומס לחלוטין. הוסף תמיסת סטוק של DNP להשמדת תאים לתערובת הבדיקה עד לריכוז סופי של 0.1 milligrams per milliliter.

יש לקחת בחשבון שכל פלטה דורשת כ-20 milliliters של תמיסה, ונדרשים 50 milliliters נוספים כדי לפצות על נפח מת, (dead volume). הגדירו את ה-Q fill three כפי שנעשה קודם לכן עבור תערובת הבדיקה לכל פלטה באמצעות ה-Q fill three. מילוי של כל פלטה אורך כ-20 שניות.

לאחר הוספת תערובת הבדיקה, דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C למשך 12 עד 16 שעות. בתוך קופסת לחות, הוציאו את הפלטות מהמדגירה בטמפרטורה של 37 °C. הניחו את המכסים בצד והניחו את הפלטות על פלטפורמת טעינת המגזין המסופקת עם ה-rapid stack באותו אופן כפי שנעשה קודם לכן.

פתחו את תוכנית הסריקה והגדירו אותה כפי שנעשה בעבר, למעט המדידה הפוטומטרית, שצריכה להיות מוגדרת לקריאה ב-400 nanometers. לאחר מכן, הזינו את הפרמטרים לתוכנת ה-POLARA RS, כפי שהודגם קודם לכן.

אפשרו לסורק ה-Vario לקרוא את הפלטות. לאחר סיום ההרצה, הסירו את הפלטות והשליכו אותן. כדי לייצא את קריאות הבליעה, פתחו את התוכנה scan it re ובחרו.

פתח קובץ קיים. בחר את הספריה שבה נשמר הסשן ולחץ על אייקון הפלוס כדי להרחיב את הרשימה. תחת כותרת הכותרת יופיעו אפשרויות המסומנות כ-container one עד container N. בהתאם למספר המגשים, בחר בתפריט העליון של הדף את המגש הראשון לניתוח, ובחר ב-data report export.

בחרו אפשרויות לייצוא, כגון פריסת הפלטה ונתונים פוטומטריים. לחצו על "view report" (צפייה בדוח), ולאחר מכן על "file save" (שמירת קובץ). בחרו את הספריה הרצויה.

פורמט הפלט הוא גיליון Microsoft Excel. כאן מוצגות קריאות של בליעה (absorbance) מלוח 384 בארות בודד המכיל שיבט חיובי; כפי שניתן לראות, שיבטים חיוביים מראים עלייה בולטת בבליעה בהשוואה לשיבטים שאינם מביעים פעילות של cellulase.

הבדלים בזמן הבדיקה, בבאר, במיקום על הפלטה או בריכוז ה-DNP עשויים להשפיע על קריאות הבליעה המוחלטות. קריאות בליעה יחסיות, כגון ההפרש בבליעה מעל הממוצע של הפלטה או הממוצע של העמודה, הן שיטה מהימנה יותר לזיהוי שיבולים חיוביים לצלולאז. הרגע הראינו לכם כיצד לזהות שיבולים חיוביים לצלולאז מספרייה מטגנומית.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להמיס את ה-DNP cell bio side ב-DMSO ולהדגיר את הפלטות בתא לחות. זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.