כימות dsDNA באמצעות ה-F-7000 Hitachi Fluorescence ספקטרופוטומטר ו PicoGreen דיי
5 בנובמבר 2010
הפגנה של כימות dsDNA באמצעות מולקולרית בדיקות PicoGreen לצבוע Hitachi ו-F-7000 ספקטרופוטומטר Fluorescence מצויד אביזר microplate הקורא.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים את היכולת של הספקטרופוטומטר הפלואורסצנטי F 7, 000 עם קורא מיקרופלייטים לבצע כימות של DNA דו-גדילי באמצעות צבע Pico green. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת הדגימות והריאגנטים. השלב השני של הפרוצדורה הוא הגדרת המכשיר.
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא טעינת הדגימות לקורא המיקרופלטה. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ביצוע המדידה של התמיסות הסטנדרטיות והדגימות. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות עקומת כיול ליניארית, שניתן להשתמש בה לצורך כימות DNA דו-גדילי של דגימות לא ידועות.
הפעילו את ה-Hitachi F 7, 000 Spectra Fluorimeter כדי לאפשר למנורת ה-Xenon להתחמם במשך שעה אחת ב-Excel. צרו קובץ הכולל את הסטנדרטים ונתוני הדגימות ושמרו אותו בפורמט של ערכים מופרדים בפסיקים או CSV. כדי להגדיר את הפלואורימטר, לחצו תחילה על כפתור ה-method הפותח את חלון שיטת האנליזה.
בשדה המדידה, בחרו photometry מהתפריט הגלילה. כעת לחצו על לשונית quantitation. בשדה סוג הכמות (quantitation type), בחרו wavelength כדי לציין כי קריאת הפלואורסצנציה תבוצע באמצעות אורך גל ספציפי.
עבור סוג הכיול, בחרו בסדר ראשון (first order), ועבור מספר אורכי הגל, בחרו באחד. הזינו nanograms per milliliter כיחידת ריכוז. ודאו שהתיבות של כיול ידני (manual calibration) והעברת העקומה דרך אפס (force curve through zero) אינן מסומנות. עבור מספר הספרות לאחר הנקודה העשרונית, בחרו בשתיים; הזינו אפס עבור הגבלה תחתונה של הריכוז, ו-10,000 עבור שדה הגבלה עליונה של הריכוז.
בשלב הבא, לחצו על לשונית instrument ובשדה data mode בחרו fluorescence. ודאו ששדה chopping speed אינו פעיל, שכן הוא משמש למדידות phosphorescence בלבד. בשדה wavelength mode, בחרו ב-WL fixed עבור שדה ex WL, והזינו 480 nanometers בשדה EM WL.
הזינו 520 nanometers. השאירו את כל שאר השדות תחת EX ו-EM כלא פעילים. הגדירו הן את ex slit והן את EM slit ל-5.0 nanometers.
באמצעות התפריטים הנפתחים, השאירו ללא סימון את התיבה שלפני השדה PMT voltage one to 1000 volts. עבור PMT voltage, בחרו 700 volts מהתפריט הנפתח. כמו כן, בחרו שתיים עבור auto statistic calc number, אחת עבור replicates, 0.1 seconds עבור integration time ואפס עבור delay.
כעת פתחו את לשונית הניטור (monitor) והגדירו את השדה של המקסימום בציר ה-y ל-10,000 ואת המינימום בציר ה-y לאפס. לאחר מכן, סמנו את התיבה משמאל לאפשרות עיבוד נתונים לאחר רכישת נתונים (open data processing after data acquisition), ובמידת הצורך, את התיבה משמאל לאפשרות הדפסת דוח לאחר רכישת נתונים (print report after data acquisition) עבור דוח שיודפס באופן אוטומטי עם סיום הקריאות. לבסוף, כדי לשמור את כל הפרמטרים שנבחרו בלשוניות השונות של חלון שיטת הניתוח, לחצו על לשונית כללי (general) ושמרו תחת שם קובץ חדש במיקום מוגדר.
לחצו על כפתור האישור (okay) כדי לסגור חלון זה. בכך הושלמה הגדרת פרמטרי הבדיקה של המכשיר. כדי להגדיר את קורא המיקרופלייטים, לחצו על כפתור ה-MPR כדי להבאי את חלון הגדרות ה-MPR לקדמת המסך.
ראשית, בחרו את הבארות עבור התקנים. לדוגמה, לחצו על מיקום A1 וגררו את העכבר עד ל-E1. לאחר מכן, לחצו על כפתור הגדרת התקנים (standard set).
פעולה זו תבחר את המיקומים שישמשו עבור התמיסות הסטנדרטיות, כפי שמודגש בצבע ירוק. לאחר מכן, בחרו את המיקומים עבור הדגימות. באופן דומה, לחצו וגררו את העכבר מעל המיקומים המתאימים בלוחית, ואז לחצו על כפתור סט הדגימות, שיסמן באופן אוטומטי את המיקומים הנבחרים בצבע צהוב.
המשיכו לחזור על אותה פעולה עבור המיקומים של מדידות הדגימה הרצויות. כדי להטעין את מידע התקנים והדגימות אל קובץ ה-CSV (ערכים מופרדים בפסיקים) שהוכן קודם לכן, לחצו על לשונית מידע הבארים (well information) בחלון הגדרות ה-MPR.
לחצו על כפתור טעינת מידע על הבארים (load well information) וייפתח חלון Windows Explorer לצורך זיהוי קובץ ה-csv עם מידע על הבארים. לאחר טעינת המידע, החלון אמור להופיע כטבלה. כדי להכין תמיסת עבודה של ריאגנט Pico green, הוסיפו 50 µL של ריאגנט pico green בריכוז 200 X ל-9.95 mL של באפר TE.
עבור עקומת הסטנדרט, הכינו דילולים סדרתיים של DNA דו-גלימי מסוג Lambda בבופר TE לריכוזים סופיים הנעים בין 1 ל-100 nanograms per milliliter. טפטפו 150 µL מכל סטנדרט לבארות ייעודיות בלוח 96 בארות. לאחר מכן, טפטפו 150 µL מכל דגימת בדיקה לבארות הייעודיות המתאימות בלוח. כעת, באמצעות פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 150 µL של תמיסת Pico green לכל בארה וערבבו את התמיסה עם דגימות ה-DNA.
דגרו בעדינות את הפלטה באזור חשוך למשך שתי עד חמש דקות כדי לאפשר לתגובה להתפתח. לחצו על כפתור מסך התצוגה של ה-MPR כדי להעלות את חלון ההגדרות של ה-MPR לקדמת המסך, ולחצו על כפתור מיקום ההחלפה. פלטפורמת ההחזקה של המיקרופלטה תזוז לכיוון קדמת המכשיר; פתחו את דלת קורא המיקרופלטות, הניחו את פלטת 96 הבארים על פלטפורמת ההחזקה כאשר באר A1 פונה קדימה, וסגרו את דלת קורא המיקרופלטות.
לחצו על כפתור מיקום ההתחלה (initial position) כדי להציב את מיקום A של אחת המיקרופלטות במיקום המדידה. לחצו על כפתור תצוגת המסך כדי להעלות את חלון המדידה לקדמת התצוגה. לחצו על כפתור המדידה כדי להתחיל במדידת התמיסות הסטנדרטיות והדגימות הבלתי ידועות.
עקומת כיול טובה מוערכת באמצעות הפרמטרים השונים המסופקים על ידי תוכנת ה-F 7,000. לדוגמה, לעקומת כיול אידיאלית זו, שהתקבלה לצורך כימות של DNA דו-גדילי באמצעות צבע Pico green, מקדם דטרמינציה מחושב של 0.99993. המערכת בעלת הסבירה הגבוהה המתוארת היא הרכבה סדרתית של טכנולוגיות הכוללת את צבע Pico Green, ספקטרופוטומטר פלואורסצנציה מדגם Hitachi F 7,000, המצויד בקורא פלטות (Microplate reader) ותוכנה לאוטומציה של איסוף נתונים, אחסון, ניתוחים והצגה.
שילוב של טכנולוגיות עוצמתיות יכול לתת מענה לצורך הגובר בניתוח מדויק של כמויות קטנות של DNA דו-גדילי.
סקירה כללית
מאמר זה מדגים את הכימות של DNA דו-גדילי (dsDNA) באמצעות צבע PicoGreen וספקטרופוטומטר פלואורסצנציה מדגם Hitachi F-7000 עם קורא מיקרו-פלטה. הפרוטוקול מפרט את הכנת הדגימות, הגדרות המכשיר ותהליכי המדידה להשגת עקומת כיול ליניארית לצורך כימות ה-dsDNA.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ספקטרוסקופיית פלואורסצנציה
- כימות DNA
- טכנולוגיית קורא מיקרו-פלייטים
רקע
- צבע PicoGreen הוא צבע פלואורסצנטי רגיש המשמש לכימות dsDNA.
- ה-Hitachi F-7000 הוא ספקטרופוטומטר פלואורסצנציה ורסטילי.
- כימות מדויק של DNA הוא חיוני לניסויים ביולוגיים שונים.
- מערכות בעלות תפוקה גבוהה (High-throughput) מקלות על ניתוח של מספר דגימות בו-זמנית.
מטרת המחקר
- להדגמת יכולתו של הספקטרופוטומטר F-7000 לכימות dsDNA.
- לביסוס שיטה מהימנה למדידת דגימות DNA לא ידועות.
- ליצירת עקומת כיול ליניארית לצורך כימות מדויק.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת ריאגנט PicoGreen ותקני DNA.
- הגדרת הפרמטרים בספקטרופוטומטר Hitachi F-7000.
- טעינת דגימות לקורא המיקרו-פלטה.
- מדידת פלואורסצנציה ליצירת עקומת כיול.
תוצאות עיקריות
- עקומה ליניארית של כיול נקבעה לצורך כימות dsDNA.
- השיטה הדגימה רגישות ודיוק גבוהים.
- התוצאות הראו מקדם דטרמינציה של 0.99993.
- המערכת ניתחה ביעילות כמויות קטנות של dsDNA.
מסקנות
- השילוב של צבע PicoGreen וספקטרופוטומטר F-7000 מספק שיטה חסונה לכמיות DNA.
- גישה זו, בעלת תפוקה גבוהה, עונה על הדרישות לניתוח מדויק במחקר ביולוגי.
- ניתן ליישם את השיטה במגוון מחקרים הדורשים מדידות מדויקות של DNA.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
כימות מדויק של DNA דו-גדילי הוא דרישה בסיסית לתיקוף מטרה, פיתוח בדיקות ויצירת מודלים פרה-קליניים במחקר ופיתוח בביופארמה. הספקטרופוטומטר הפלואורסצנציה Hitachi F-7000 עם צבע PicoGreen מאפשר מדידה ברגישות גבוהה ובתפוקה גבוהה של dsDNA, ובכך תומך ביצירה אמינה של עקומת סטנדרט עבור יישומים המשכיים. שיטה זו מספקת ביטחון חיזוי בכימות חומצות גרעיניות, מפחיתה שונות בתהליכי עבודה בשלבי גילוי מוקדמים ומאפשרת יצירת נתונים ניתנים לשחזור ובקנה מידה רחב לאורך סריקות של תרכובות ומחקרי סמנים ביולוגיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר מדידה מדויקת של ריכוזי dsDNA לצורך שיבוט, טרנספקציה ובדיקות תיקוף של מטרות מבוססות PCR.
- ערך תפעולי: תומך בהכנה וכמותיות הדירות של דגימות, ובכך מפחית שונות טכנית בניסויים מונחי-היפותזה.
- ערך חיזוי: מייצר עקומות כיול ליניאריות עם מקדמי דטרמינציה גבוהים (R² > 0.999), המבטיחים כימות מדויק של דגימות לא ידועות במחקרי מעורבות מטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק קריאות פלואורסצנציה כמותיות התואמות לפורמטים של 96 בארות לצורך סטנדרטיזציה של בדיקות ותיטור ריאגנטים.
- ערך תפעולי: מאפשר מדידה מהירה של 96 בארות בפחות מ-60 שניות באמצעות מצב קינטיקה, מה שתומך במוכנות לסריקה בעלת תפוקה גבוהה.
- מדרגיות: התוכנה מאפשרת שמירה ושליפה של תצורות פלטות מיקרו, מה שמקל על הגדרה עקבית של הבדיקה בין צוותים ופרויקטים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: מספק כימות אמין של dsDNA לצורך ניתוח סממנים ביולוגיים, תיקוף PCR וייצור וקטורים במודלים פרה-קליניים.
- הפחתת סיכונים: רגישות גבוהה (50 picomoles שווי ערך לפלואורסצאין) וטווח דינמי רחב (5 סדרי גודל) מאפשרים כימות מדויק לאורך סדרות דילול, ובכך מפחיתים תוצאות שגויות שליליות במטרות בעלות שכיחות נמוכה.
- שילוב בזרימת העבודה: מייצא נתונים לקובצי Excel או לפורמטים של דוחות, מה שמאפשר העברה חלקה לצינורות עיבוד של ביואינפורמטיקה וניתוח נתונים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאישור מוקדם של מטרה, דרך זיהוי מובילים ועד לפיתוח פרה-קליני, שבהם כימות מדויק של חומצות גרעיניות הוא חיוני לשחזור ניסויי ולשלמות הנתונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי מתן אפשרות למדידה מדויקת של dsDNA לצורך יעילות שיבוט, ניתוח ביטוי גנים ומחקרי מוטגנזה.
- סריקה: מספקת פלטי פלואורסצנציה כמותיים הניתנים לשחזור, התומכים בחוסן של הבדיקה ובנורמליזציה של ספריות תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת עקומות כיול ליניאריות ומקדמי קביעה (R²) המאפשרים השוואה בין ניסויים ובקרת איכות.
- מחקר תרגומי: מקשרת לרציפות פרה-קלינית באמצעות כימות מהימן של DNA בניסוחי תרופות, וקטורים ויראליים ובדיקות של סמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: תוכנה ניתנת להגדרה ופרוטוקולים סטנדרטיים מאפשרים שימוש חוזר בין מחלקות, מה שמפחית את הצורך בפיתוח מחדש של שיטות ומגביר את היעילות התפעולית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: רגישות וסגוליות גבוהות ל-dsDNA מפחיתות אותות שגויים ומשפרות את המהימנות של הנתונים בסבבים מולקולריים.
- ערך תפעולי: איסוף, אחסון והצגה אוטומטיים של נתונים באמצעות תוכנה ממזערים טיפול ידני ושגיאות העתקה.
- ערך אסטרטגי: כימות מהימן תומך בהחלטות go/no-go באופטימיזציה של מובילים (leads) על ידי הבטחת מינון ונורמליזציה מדויקים בבדיקות פונקציונליות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון באמצעות אספקת נתונים מהימנים על חומצות גרעיניות לבחירת מועמדים ומחקרי פורמולציה.
שיקולי יישום
- נדרשת היכרות עם ספקטרוסקופיית פלואורסצנציה ותפעול של קורא מיקרו-פלטה.
- נדרשת גישה לספקטרופוטומטר Hitachi F-7000 עם אביזר קורא מיקרו-פלטה ותוכנה תואמת.
- נדרשת הכנה סטנדרטית של ריאגנטים (דילול PicoGreen בבופר TE) וטיפול בדגימות כדי למנוע כיבוי פלואורסצנציה.
- כולל אופטימיזציה של זמן הדגרה (2–5 דקות בחושך) והגדרות אורך גל (Ex 480 nm, Em 520 nm) לצורך עקביות האות.
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך בהדגרה בחושך והפרעה פוטנציאלית ממזהמים או מממסים אורגניים.
