בדיקת הכלאה מפוצלת המשתמשת באפטמר אור פלואורסצנטי של DNA כמדווח אותות לניתוח חומצות גרעין ספציפיות לרצף
8 ביולי 2025
פרוטוקול זה מתאר את התכנון של בדיקות הכלאה מפוצלות תוך שימוש באפטמר מואר פלואורסצנטי DAP-10-42 כמדווח אותות ויישומם לזיהוי חומצות גרעין והבחנה בין מטרות עם החלפות נוקלאוטידים בודדים.
אנו מפתחים סוגים חדשים של בדיקות הכלאה פלואורסצנטיות לניתוח חומצות גרעין ספציפיות לרצף. לאחרונה, כלי ניתוח הכלאה התרחבו עם מבחנים המנצלים את מערכות CRISPR-Cas. נכון לעכשיו, בדיקות הכלאה מתקדמות, כגון TaqMan, ובדיקות משואות מולקולריות, משמשות בעיקר לניתוח מטרות של חומצות גרעין.
זיהוי מדויק של תחליפי נוקלאוטידים בודדים ומטרות חומצות גרעין עדיין מאתגר כמעט. הפרוטוקול שלנו מבטיח את הרמה הנדרשת של פעילות התא תוך מתן קריאת אות פלואורסצנטי ללא תוויות. כדי להתחיל, תכנן את הרצפים של שני גדילי אוליגונוקלאוטידים של DNA לא מותאמים המהווים SLAS.
השתמש בשבר המכיל נוקלאוטידים עבור 6 עד 39 של DAP-10-42. המר גזע 1 המורכב מנוקלאוטידים 1 עד 8 ו-36 עד 42 לגזע 1 ראשוני על ידי הסרת תימין בולט במיקום 5, קיצור הגבעול לארבעה זוגות בסיסים והוספת זוג בסיסים ציטוזין-גואנין טרמינלי. כלול נוקלאוטידים 9 עד 29 בגדיל SLAS אחד ונוקלאוטידים 30 עד 35 בשני.
הרחב את הרצף הסופי של שלושת הראשוניים של השבר עם נוקלאוטידים 9 עד 29 על ידי הוספת דאוקסי GGTCAT. לאחר מכן הרחב את רצף חמשת הטרמינלים הראשוניים של המקטע 30 עד 35 עם דאוקסי TGACC ליצירת גזע זוג שישה בסיסים 2. כעת הרחב את גזע 1 ראשוני בשני הגדילים עם מקשרים דאוקסי TT, ורצפי DNA משלימים למטרה של חומצת הגרעין.
זה מניב את רצפי הגדילים SLAS-U ו-SLAS-S המרכיבים את הבדיקה. הפוך את SLAS-S לחינם לאזור של 7 עד 10 נוקלאוטידים. זה כולל את אתר החלפת הנוקלאוטידים היחיד.
לאחר מכן ודא שזרוע קשירת המטרה של SLAS-U משלימה לשבר נוקלאוטידים של 15 עד 25 הסמוך לאזור SLAS-S. הערך את טמפרטורות ההיתוך של דופלקסי קשירת היעד באמצעות שרת האינטרנט UNAFold. לחץ על הכרטיסייה INAMelt.
עבור אל יישומים ובחר היברידיזציה של התכה של שני מצבים. הזן את הרצפים המקיימים אינטראקציה בסדר של חמישה ראשוניים עד שלושה ראשוניים בתיבות השמאלית והימנית. לאחר מכן התאם את טמפרטורת הבדיקה ל-22 מעלות צלזיוס והזן את ריכוזי הקטיונים החד-ערכיים והדו-ערכיים ליונים של 20 מילי-מולרי ו-25 מילי-מולארי, בהתאמה.
התאם את הריכוזים של רצפי האינטראקציה בתיבה המתאימה. לחץ על שלח וסקור את ערכי שינוי האנרגיה, האנטרופיה, האנטרופיה וטמפרטורת ההיתוך של גיבס עבור הדופלקסים המתאימים. ודא שטמפרטורות ההיתוך עבור מטרות תואמות לחלוטין וזרועות קשירת המטרה של SLAS-S ו-SLAS-U הן מעל טמפרטורת הבדיקה, 22 מעלות צלזיוס.
ודא שהדופלקס בין SLAS-S ליעד לא תואם מניב טמפרטורות התכה מתחת לטמפרטורת הבדיקה כדי לשמור על ספציפיות. במידת הצורך, התאם את אורכי זרועות קשירת המטרה כדי לעמוד בתנאים אלה. השג את גדילי האוליגונוקלאוטידים הסופיים של SLAS-U ו-SLAS-S מספק DNA מסחרי או סנתז אותם בתוך הבית באמצעות סינתיסייזר DNA אוטומטי.
הכן פתרונות מלאי של Auramine O, SLAS-S, SLAS-U ומאגר בדיקה. הכן את תערובת המאסטר המכילה את כל רכיבי הבדיקה מלבד המטרה. הוסף מים נטולי נוקלאז לכרך האחרון של חמשת הכרכים האחרונים עד השישי של תערובת המאסטר.
ואז מערבולת וסובב את תערובת המאסטר. הוצא 50 מיקרוליטר לכל צינור דגימה. לאחר מכן, סמן דגימה אחת כחסר יעד ריק ואחת כביקורת חיובית.
הוסף 10 מיקרוליטר של דגימה המכילה מטרה לצינור המכיל את תערובת המאסטר כדי ליצור דגימה של 60 מיקרוליטר. עבור הריק, הוסף 10 מיקרוליטר מים ללא נוקלאז. לאחר מכן פיפטה 10 מיקרוליטר של DNA סינתטי אוליגונוקלאוטיד המכיל את רצף המטרה לתוך צינור הבקרה החיובי.
מערבבים את כל הדגימות בצנטריפוגה בקצרה באמצעות מיקרו-צנטריפוגה. לאחר מכן דגרו על הצינורות בטמפרטורה של 22 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 60 דקות. מדוד פלואורסצנטיות ב-540 ננומטר בעת עירור ב-475 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי.
SLAS הותאם כדי להתמקד במקטע ספציפי של הגן NANOGP8. יעד M היה מחמיא לחלוטין לגדיל SLAS-S, בעוד שלמטרה MM היה מיקום נוקלאוטיד ציטוזין 1, 423, מה שהציג אי התאמה עם SLAS-S. עם הוספת היעד המלא M, הקרינה עלתה בהתמדה והתייצבה לאחר 45 עד 50 דקות.
עם זאת, אות ברור היה ניתן לזיהוי תוך 10 דקות עם יחס אות לריק של 10 SLAS הראה אות פלואורסצנטי גבוה עבור מטרות תואמות לחלוטין, אך לא עבור מטרות או ריקים לא תואמים. תפוקת הקרינה גדלה באופן ליניארי עם ריכוז המטרה עד 500 ננו-מולר, מה שמאפשר כימות וקביעת גבולות הזיהוי. דגימות מוגברות PCR הראו רמות שונות של אות כאשר רק דגימה 2 חרגה מערך סף הקרינה של 2.
בהתבסס על עקומת הכיול, ריכוז האמפליקון NANOGP8 במדגם 2 הוערך ב-124+או 13 ננו-מולר. זיהוי הקרינה של אות SLAS היה עקבי הן בספקטרופוטומטר שולחני והן בפלואורומטר נייד. יחס אות לריק מעל 20 נצפה גם חזותית באמצעות אור UV.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את הפיתוח של גששים להיברידיזציה פלואורסצנטית לצורך ניתוח ספציפי של חומצות גרעיניות, תוך התמקדות בשימוש ב-DAP-10-42 כדווח אות. הוא עוסק באתגרים הכרוכים בגילוי תחליפים של נוקליאוטיד בודד.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גששים להיברידיזציה פלואורסצנטית
- זיהוי חומצות גרעיניות
- החלפות נוקלאוטיד בודדות
רקע
- כלי ניתוח היברידיזציה נוכחיים כוללים גששים מסוג TaqMan ו-molecular beacon.
- זיהוי מדויק של מטרות חומצות גרעין נותר מאתגר.
- מערכות CRISPR-Cas הרחיבו את יכולות ניתוח ההיברידיזציה.
- קריאות של אותים פלואורסצנטיים ללא סימון הן חיוניות לניתוח יעיל.
מטרת המחקר
- לתכנן פרובים להיברידיזציה מפוצלת (split hybridization probes) לזיהוי משופר של חומצות גרעיניות.
- להבדיל בין יעדים בעלי substitutions של נוקלאוטיד בודד.
- להבטיח את פעילות התאים תוך אספקת אותות פלואורסצנטיים מדויקים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון של שני גדילים של אוליגו-נוקלאוטידי DNA לאי-מודיפיקציה.
- שימוש באפטמר פלואורסצנטי "Light-up" מסוג DAP-10-42.
- יישום של פרובים להיברידיזציה מפוצלת (split hybridization probes) בניתוח חומצות גרעין.
- הערכת יעילות קריאת האות.
תוצאות עיקריות
- תכנון מוצלח של פרובים להיברידיזציה מפוצלת (split hybridization probes).
- הבחנה יעילה בין מטרות של חומצות גרעיניות.
- הדגמה של קריאת אות פלואורסצנטי ללא סימון (label-free).
- דיוק משופר בזיהוי תחליפים של נוקלאוטיד בודד.
מסקנות
- הגששים שפותחו משפרים את יכולות הגילוי של חומצות גרעיניות.
- הם מספקים שיטה אמינה לניתוח וריאציות של נוקליאוטיד בודד.
- גישה זו עשויה לקדם את התחום של ניתוח חומצות גרעיניות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
ניתוח חומצות גרעין ספציפי לרצף באמצעות גששים להיברידציה מפוצלים עם אפטמרים של DNA המאירים בבת-אור פלואורסצנטי (FLAPs) נותן מענה לאתגר המתמיד של זיהוי תחליפים של נוקליאוטיד בודד בספציפיות גבוהה ובביטחון כמותי. גישה זו מאפשרת קריאות מבוססות פלואורסצנציה ללא סימון, חסכוניות וניתנות להרחבה, התומכות בתיקוף יעדים חסון ובצמצום סיכונים מכניסטיים בתהליכי גילוי וסריקה מוקדמים. הסלקטיביות של השיטה והפלט הכמותי שלה רלוונטיים ישירות למיון תיקי פיתוח ולהחלטות קידום מותאמות סיכון במחקר ופיתוח ביו-פארמצבטי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי זיהוי החלפות של נוקליאוטיד בודד בסלקטיביות גבוהה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות פלטי פלואורסצנציה כמותיים וספציפיים לרצף.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבחנה בין מטרות חומצות גרעיניות תואמות באופן מושלם למטרות עם אי-התאמה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות בדיקה מאומתות ללא סימון (label-free) עבור תהליכי סינון המשכיים.
- מספק מדידות פלואורסצנציה סטנדרטיות, ניתנות לשחזור וכמותיות לצורך פיתוח בדיקות.
- מאפשר מוכנות לסינון מהיר, בר-הרחבה ונייד, תוך שימוש בפלטפורמות גילוי פלואורסצנציה קונבנציונליות או ניידות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- תומך בהלימה של ביומרקרים תרגומיים על ידי מתן אפשרות לגילוי של וריאנטים של נוקליאוטיד בודד בעלי רלוונטיות קלינית.
- מספק רציפות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות תוצרים כמותיים וספציפיים לרצף.
- מפחית סיכון ביולוגי על ידי מתן אפשרות להבחנה מדויקת של וריאנטים מטרה בדגימות מורכבות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פלטפורמת גששי ההיברידיזציה המפוצלת זו משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם, דרך זיהוי מובילים ועד למחקר פרה-קליני, ותומכת בבדיקת היפותזות, פיתוח בדיקות ותיקוף של סמנים ביולוגיים תרגומיים.
- ביולוגיית גילוי: מקלה על בדיקת היפותזות והבהרת מסלולים על ידי מתן אפשרות לגילוי חומצות גרעין ספציפיות לרצף.
- סריקה: מספקת פלטי פלואורסצנציה כמותיים וניתנים לשחזור להערכה אמינה של תרכובות או מטרות.
- אנליטיקה: מספקת קריאות מדידות והבחנה סטטיסטית בין מטרות תואמות לבלתי תואמות.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם מחקרים מונחי ביומרקרים על ידי מתן אפשרות לגילוי וריאנטים של נוקליאוטיד בודד בדגימות רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה יכולת גילוי ללא סימון, ניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה למגוון מטרות של חומצות גרעין וזרימות עבודה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ואת תיקוף המטרה על ידי מתן רזולוציה של נוקלאוטיד בודד.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ופישוט של זרימות העבודה של הבדיקה באמצעות זיהוי בר-הרחבה ללא סימון.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go ואת היעילות ההונית על ידי הפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכון ובקידום תוכניות גילוי ותוכניות פרה-קליניות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון גששים לחומצות גרעין ובניתוח טמפרטורת התכה.
- נדרשת גישה לספקטרופוטומטרים פלואוריסצנטיים או פלואורומטרים ניידים לקריאה כמותית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של סינתזת הגשש ותנאי הבדיקה לצורך הדירות.
- ניתן להתאמה למטרות שונות של חומצות גרעין על ידי התאמה אישית של רצפים משלימים וזרועות הגשש.
- הספציפיות תלויה באופטימיזציה קפדנית של יציבות הדופלקס בין הגשש למטרה ובטמפרטורת הבדיקה.
