השימוש זרימה טפטוף ו כורים דיסק סיבוב עבור Staphylococcus aureus Biofilm ניתוח

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לגדל ביופילמים חיידקיים תחת כוח גזירה נמוך או בינוני, באמצעות ריאקטור ביופילם בעל זרימת טפטוף או ריאקטור בעל דיסק מסתובב. קופונים בריאקטור הביופילם מוחדרים תחילה בחיידקים ומודגמים בטמפרטורה של 37 °C כדי לאפשר לתאי החיידקים להיצמד למשטחי הגדילה. לאחר שהתאים נצמדו לקופונים, מופעלת זרימה של מצע גידול היוצרת כוח גזירה הפועל במהלך התפתחות הביופילם.

ניתן לקצור ביופילמים בוגרים לצורך ניתוח ותצפית על הביופילמים. ניתן לבצע מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת כדי לקבוע את המבנה העל (ultra structure) של הביופילמים שנוצרו. אני בלייז בולס.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תאי זרימה, הוא שניתן להשיג בקלות ייצור ביומסה גבוה ובנייה של מספר ביופילמים זהים. את ההליך זה ידגימו רייצ'ל סטיבנסון וקלי שוורץ, טכנאית ותלמידה לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. כור ביופילם עם זרימה בטפטוף מורכב מארבעה תאים עם פתחי כניסה למדיום ופתחי יציאה לפסולת.

בתוך כל תא נמצא קופון נשלף שעליו גדל הביופילם. כדי להרכיב את כור הביופילם בזרימה בטפטוף, מקמו את הקופונים בכל תא מקבילי והדקו את מכסי התאים. עקרו באוטוקלאב את הכור המורכב וכן את צינורות הזנת חומרי התזונה כדי לעקר את המערכת לפני השימוש.

בצעו גם עיקור באוטוקלאב של מצע גידול הביופילם כדי להחדיר אותו למגיב הזרימה בטפטוף המעוקר. הניחו את המכשיר על משטח ישר והדקו את קווי השפכים. לאחר מכן, מלאו כל תא ב-10 milliliters של מצע גידול סטרילי המבוסס על triptych soy broth, והוסיפו 100 microliters של staphylococcus aureus.

תרבית לילה שגודלה באותו מצע עבור כל תא בנפרד. יש להניח את הכור המוחדר באינקובטור בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 18 שעות כדי לאפשר לתאים להיצמד לפני השטח של הקופון. לאחר האינקובציה, יש לשחרר את התפסן של צינור השפכים ולהניח את הכור על גבי בלוק עץ נטוי בזווית של 10 degree באופן אספטי.

חברו את צינורות ההזנה הזורמים לבקבוק המכיל ציר הזנה בזרימה רציפה. העבירו את קו הצינורות דרך המשאבה ובצעו הטרייה (priming) לצינורות על ידי הפעלת המשאבה במהירות מלאה. לאחר שהצינורות הזורמים הוטריו, עצרו את המשאבה וחברו מחטים במידה 22 gauge ובאורך שפה אחת לקצה של כל צינור.

נגב את פקק כניסת התא באמצעות מטלית עם אתנול ובאופן אספטי. החדר את המחטים דרך פקק הכניסה. הפעל את המשאבה ואפשר למדיום לטפטף על הקופונים.

בספיקה של כ-125 microliters per minute, המדיום צריך לזרום כלפי מטה מפתח פקק הכניסה אל פתח השפכים. הפעילו את הכור בזרימה רציפה למשך שלושה ימים, ובדקו מדי פעם שהניקוז מהכור תקין.

יש לבדוק את הניקוז באמצעות בדיקה ויזואלית של התאים כדי לוודא שהמדיה אינה מצטברת בהם. אם המדיה מצטברת, לחיצה על צינור היציאה תסייע בדרך כלל לניקוז תקין לצורך קציר של הביופילמים; במקרה זה, יש לעצור את המשאבה ולהוציא את המחטים מהריאקטור. לאחר מכן, יש להניח את הריאקטור על משטח שטוח.

לאחר שלושה ימים של זרימה רציפה, ביופילמים של staphylococcus aureus מופיעים כביומסה צהובה המפוזרת לאורך הקופונים שהוחדרו. מיקרוגרף של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של הביופילם חושף את staphylococcus aureus מכסה את הקופון בקהילת ביופילם הקשורה לפני השטח. כדי לכמת את הביומסה שהתקבלה, השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להוציא את הקופונים באופן אספטי, אספו את החיידקים באמצעות גורד תאים (cell scraper), ולאחר מכן העבירו אותם לשפופרת קונית המכילה חמישה מיליליטר של PBS סטרילי.

באמצעות הומוגנייזר רקמות, פצלו את הגושים הבקטריאליים עד לקבלת סספנסיה אחידה. יחידות יוצרות מושבות (CFU) נמדדות על ידי זריעה של דילולים סדרתיים על צלחות triptych agar, דגירה למשך 24 שעות ב-37 degrees Celsius וספירת המושבות. ריאקטור הביופילם בעל הדיסק המסתובב מורכב מ-chemostat שדרכו מנוסב מצע גידול.

דיסק מסתובב עם מוט כוכב ו-18 קופונים שתוכננו להתאים לדיסק המסתובב. כדי להרכיב את הכור, תחילה טענו את קופוני הדיסק המסתובב לתוך החריצים של הדיסק המסתובב. לאחר מכן, הניחו את הדיסק הטעון בתוך כלי ביקר זכוכית של ליטר אחד עם פתח גלישה, ואטמו את הכור בעזרת פקק גומי מספר 15 בעל חור אחד לזרימת המצע וחור אחד לאוורור.

עקרו באוטוקלאב את הכור המורכב ואת צינור הכניסה כדי לעקר את המערכת. כדי להחדיר את התרבית לכור, מלאו את הכוס ב-250 milliliters של מצע גידול סטרילי והוסיפו 500 microliters של תרבית לילה של staphylococcus aureus שגודלה ב-triptych soy broth. הניחו את הכור על פלטת ערבוב המכוונת ל-250 rotations per minute והדגירו אותו למשך לילה ב-37 degrees Celsius כדי לאפשר לתאים להיצמד לקופונים.

לאחר דגירה לילה, חברו את צינור הכניסה לפתח במאגר המצע ואל משאבה פריסטלטית. הפעילו את המשאבה וקבעו את קצב הזרימה ל-0.25 milliliters per minute. הניחו לריאקטור לפעול במשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius כדי לאסוף את הביופילמים שהתקבלו.

עצרו את הריאקטור ובאופן אספטי, הסירו את הדיסקה מבלי לגעת בקופונים. באמצעות פינצטה סטרילית, הוציאו את הקופונים וטבלו כל אחד מהם בזהירות ב-PBS סטרילי כדי להסיר חיידקים שאינם קשורים היטב, לצורך בדיקת תרכובות אנטימיקרוביאליות.

באופן אספטי, מקם את הקופונים לבארות בודדות של פלטת 96 בארות המכילה את התרכובות הרלוונטיות. דגור את הפלטה למשך ארבע שעות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, העבר את הקופונים לשפופרות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 milliliter המכילות 1× PBS ופזר את הביופילמים באמצעות הומוגנייזר.

לבסוף, פזרו דילולים סדרתיים של התאים על מצע אגר עם חומרי הזנה כדי לקבוע את מספר יחידות יוצרות המושבות (CFU) החיות לדגימה, כפי שתואר קודם לכן. גרף זה מראה את מספר יחידות יוצרות המושבות בביופילמים שהוכנו באמצעות כור הדיסקים המסתובב ונחשפו למימן פחמוננית, עם יכולת להפיק עד 18 ביופילמים זהים. השימוש בכור הדיסקים המסתובב הופך טכניקה זו לאידיאלית לבדיקת תרכובות אנטימיקרוביאליות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן ההפעלה של ביופילמים בכור תגובה בעל זרימה בטפטוף ובכור תגובה בעל דיסק מסתובב. כורי תגובה אלו לביופילמים מציעים חלופות לביופילמים בתאי זרימה ובפלטות מיקרוטיטר, והם אידיאליים כאשר נדרשת כמות גבוהה של ביומסה של ביופילם או כאשר מעוניינים בביצוע בדיקות אנטימיקרוביאליות על ביופילמים מבוססים.