זיהום תת עורי של סטפילוקוקוס אוראוס עמיד Methicillin (MRSA)

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון את ההישרדות וההפצה של *Staphylococcus aureus* עמיד למתיצילין או MRSA, וכן את רמות הכמוקינים והציטוקינים באתרי הזיהום. הדבר מושג על ידי הסרת הפרווה מגבם של עכברים כדי לאפשר אזור תצפית ברור. כשלב שני.

MRSA בתגלוש יועבר לעכברים בהזרקה תת-עורית שלושה ימים לאחר ההדבקה; ניתן להעריך את הפתולוגיות של ההדבקה ואת ספירת החיידקים על ידי קביעת מספר יחידות יוצרות מושבות (CFU) מהומוגנאטים של רקמה על צלחות אגר. שלום, מה שלומך? שמי דה לורדון.

אני חוקרת פוסט-דוקטורט. שלום, שמי מריאל סאנצ'ס. אני סטודנטית לדוקטורט ואני אנדריאה הודה.

אני עמית מחקר, ואנו חלק מהמעבדה של George Lee במחלקה הפדיאטרית במרכז הרפואי Cedar-Sinai. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הרפואי, כגון מידול של זיהומים חמורים, כולל מיוזיטיס, פולימיוזיטיס ופסציטיס נמקית. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי זיהומי חירום חמורים, ניתן ליישמה גם על מערכות אחרות, כגון group A streptococcus ואורגניזמים אחרים.

בנוסף, אנו יכולים לחקור את התפקוד והפתוגנזה של אורגניזמים אחרים הגורמים למיאוזיטיס (myositis) ולפולימיאוזיטיס (polymyositis). באופן כללי, אנשים שאינם מנוסים בהליך זה עשויים להיתקל בקשיים מכיוון שאחד הרגולטורים הגלובליים של אזורי ה-caucus הוא מוטבילי מאוד. אם לא יינקטו אמצעי זהירות, ייתכן שביانات שנאספו יציגו שונות משמעותית, דבר שיוביל לקושי בפירוש הנתונים.

בואו נתחיל. במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL 2), הכינו צלחת אגר דם כבשים על בסיס TSA ולולאה סטרילית באמצעות בלוק הקפאה. העבירו את תרבית המקור של Mercer מהאחסון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, בעזרת לולאת ההעברה הסטרילית, השבירו שבב קרח קטן מתרבית המקור אל תוך הצלחת. מיד לאחר השגת שבב קטן של תרבית המקור של Mercer, העבירו את תרבית המקור בחזרה למקפיא כדי למנוע הפשרה, שכן הקפאה והפשרה חוזרות יפגעו בתרבית המקור. השתמשו בלולאה כדי לבצע זריעה על האגר, באופן שיסייע לצמיחה של מושבות Mercer בודדות.

דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה ללא תוספת CO2. למחרת, הכינו וסמנו both דף ביצים דם חדש, צלחת TSA ומבחנה עם מכסה snap cap בנפח 15 milliliter המכילה 3 milliliter של THB.

הוציאו את צלחת ה-M SSA שגודלה במהלך הלילה ובחנו את הפנוטיפ ההמוליטי של המושבות. בעזרת לולאה סטרילית, בחרו מושבה בעלת פנוטיפ העולה בקנה מידה עם מושבות מניסויים קודמיםים. זרעו את ה-THB עם המושבה שנבחרה באמצעות אותה שיטת זריעה בלולאה.

דגרו את תמיסת ה-THB בצלחת בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה, תוך ניעור במהירות של 220 rpm. חיידקים אלה ישמשו להרחלת התרבית עבור זיהום תת-עורי של העכברים בשלבים מאוחרים יותר. הניחו גם את צלחת אגר הדם באינקובטור.

נשתמש בצלחת למחרת בבוקר כדי לוודא שהפנוטיפ ההמוליטי של החיידקים בתמיסת ה-THB תואם לזה של המושבה שנבחרה במקור. אם הפנוטיפ ההמוליטי אינו עקבי עם השבט המקורי, אין להתחיל בניסוי. העבר את העכבר לפלטפורמה וגלח את הפרווה מגבו.

אם בעל החיים תוקפני מדי, ייתכן שיהיה צורך בטשטוש באמצעות isof fluorine. מרחו כחמישה מילימטרים מעוקבים של קרם להסרת שיער כגון NA על האזור הגולח. ניתן לרכוש NA בבית המרקחת המקומי.

הקפידו לרכוש את קרם הסרת השיער המכיל שמן תינוקות, מכיוון שהמוצר ללא שמן התינוקות יהיה מגרה מדי עבור העכברים. השאירו את הקרם להשקיה על פני העור למשך כדקה אחת; בזמן שהקרם להסרת השיער פועל, הרטיבו מספר מגבות נייר במים מזוקקים כפולה. לאחר דקה, השתמשו במגבות הנייר הרטובות כדי לנקות את האזור שגולח.

ודאו שהעור נקי מקרם להסרת שיער. חממו מראש 10 milliliters של THB בתוך מבחנה עם מכסה הברגה בנפח 50 milliliters בטמפרטורה של 37 degrees Celsius באינקובטור לבקטריות למשך ארבע עד 10 שעות. העבירו 20 microliters של תרבית בקטריות מהלילה ל-THB שחומם מראש. פעולה זו תדלל את ה-merc מהלילה.

תים בדילול של 1:500. הנח את המבחנה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור שוקר במהירות של 220 סל"ד למשך כשלוש שעות עד שעתיים וחצי. השתמש ב-THB נוסף כדי לדלל את תרחיף החיידקים לדילול של 1:10 ומדוד את התרחיף באמצעות ספקטרופוטומטר.

עם בליעה של 514 ננומטרים. המשך לדגרי את התושה ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור של 220 סיבובים לדקה עד שהתושה המדוללת ביחס של 1:10 תגיע ל-0.25. כדי לאסוף את ה-M er, סבב במ centri-fuge את המבחנה בנפח 50 מיליליטר ב-3,225 xg למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, השלף את ה-supinate Resus.

השעה את משקע החיידקים ב-10 milliliters של DPBS ושטוף את החיידקים שוב על ידי חזרה על שלב הסרטיפוגציה עבור מודל זיהום חמור זה. השעה מחדש את משקע החיידקים בכ-one milliliter של DPBS, כך שיתקבל ריכוז של כ-one times 10 to the 10 colony forming units per milliliter. הכן מצעי sheep blood A-R-T-S-A ובצע דילול סדרתי של החיידקים ב-DPBS מהדילול 10 to the one ועד 10 to the eightfold במצע.

טפטפו 10 µL מהתמיסה הבקטריאלית המדוללת בסדרה על גבי צלחת blood agar בשלוש חזרות. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. לאחר דגירה של 16 עד 18 שעות, התבוננו ורשמו את פנוטיפ ההמוליזה של המוּשבות.

ספרו את יחידות יוצרי המושבות (colony forming units) על הצלחות. ניתן יהיה לחשב את כמות האינוקולום להדבקה על בסיס מספר יחידות יוצרי המושבות על הצלחות.

הכינו מזרק עם 100 µL של תרחיף החיידקים ב-DPBS שהוכן קודם לכן. לפני ההזרקה, יש להרגיע את העכברים כך שקצב הנשימה שלהם יהיה כפעם אחת בשנייה. לצורכי הדגמה, בסרטון זה מוצג עכבר שהורדם (euthanized).

הזריקו את ה-M ser לצד אחד לאחר ההזרקה. העבירו את העכבר בחזרה לכלובו. עקבו אחר בעלי החיים למשך שלוש עד חמש שעות לאחר ההזרקה כדי לוודא שהעכבר חי לפני ההחזרה לחדר בעלי החיים.

עקבו מדי יום אחר הנגעים על גבם של בעלי החיים לאחר שהוצאו מהניסוי. מדדו ורשמו את גודלם ואת מצבם של הנגעים על העור. שטחי הנגעים בעור ובשריר נמדדים על ידי הכפלת אורך הנגע ברוחבו במילימטרים.

יש לפרק נגעים בעלי צורה לא סדירה לחלקים סימטריים קטנים יותר, ולמדוד כל חלק באותה שיטה. הכינו מבחנות מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 milliliter עם 100 microliters של DPBS לאיסוף הרקמה. בצעו חריץ בעור באמצעות להב תער סטרילי והוציאו את הנגע בעזרת מספריים סטריליים.

בעת כריתת הנגע, ודאו כי נכרתות גם כ-2 עד 5 מילימטרים של עור בריא סביב האזור. העבירו את הנגע למבחנות איסוף הרקמה לצורך ניתוח נגעי השריר. קלפו את העור בזהירות כדי למדוד את הגודל ולתעד את מצב הנגע ברקמת השריר.

אספו את הטחול והכליות. הניחו רקמות אלו במבחנות איסוף נפרדות. הומוגניזו את הרקמות על ידי ערבוב באמצעות מזרק של 1 mL למשך כ-30 שניות.

הוסיפו 900 µL של DPBS לכל מבחנה. הרכיבו את פלטות ה-THA וערבלו במערבל וורטקס את דגימות הרקמה ההומוגניות למשך חמש דקות. בצעו דילול סדרתי לדגימה.

יש לדלל את התרחיפים עד ליחס של 1:10⁶. בלוחות 96 באריים, יש להעביר 10 µL מכל תרחיף מדלל בסדרה אל הלוחות. יש להדגיר את הלוחות באינקובטור חיידקים בטמפרטורה של 37 °C למשך הלילה.

בבוקר למחרת, ספרו את יחידות יוצרי המושבות מהצלחות וחשבו את מספר יחידות יוצרי המושבות על בסיס גורמי הדילול. אם ההדבקה בוצעה כהלכה, תיראה שלפוחית על פני העור מיד לאחר ההזרקה התת-עורית. אם לא נצפתה שלפוחית, ייתכן שההזרקה הייתה עמוקה מדי, מה שעלול להשפיע על תוצאות ההדבקה.

ניתן להעריך את גודל הנגע ואת השרידות הבקטריאלית בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה ב-MSA. הנגעים הבאים בעור נבחנו ביום השלישי לאחר ההדבקה, והם מהווים דוגמאות לנגע בעכבר מסוג CD1 שהודבק בצד אחד ב-1×10⁷ colony forming units. נגעים בשרירים נמצאים בדרך כלל ברקמה שמתחת לנגעי העור.

להלן דוגמאות לנגעי שריר משטחיים התואמים לתמונות נגעי העור שהוצגו קודם לכן. אלו הם נגעי שריר שנצפו ביום השלישי לאחר ההדבקה בעכבר שהודבק ב-1 $\times$ 10⁷ יחידות יוצרי מושבות (colony forming units). שטח הנגע נקבע כמידה של אורך כפול רוחב של הנגע כפי שנמדד במילימטרים, ויש למדוד אותו כדי להעריך את נזק הרקמה בעור.

ניתן לכמת את מספר יחידות יוצרות המושבות של החיידקים הממוקמים באתר הזיהום בנגעי רקמה שהוצאו. ספירת יחידות יוצרות המושבות יכולה להצביע על כך אם גורם virulent מספק ל-MSA יתרון הישרדותי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש באמצעי הבטיחות הסטנדרטיים עקב השימוש במחטים ובמיקרובים פתוגניים מאוד בעקבות הליך זה.

לבסוף, כמודל למשס, ניתן להשתמש במינון חידוק נמוך פי 1,000 בהשוואה למודל שלנו כדי לענות על שאלות נוספות, כגון אילו גורמי S מקדמים זיהום RSA מתמשך? זכרו כי עבודה עם מזרקים מלאים ב-Mars A עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון השלכה ישירה של המזרק למכל חפצים חדים, שכן חשוב למנוע דקירה מקרית על ידי המחט. כמו כן, עבור ניסוי זה, חשוב להישמע לפרוטוקולי BSO2 סטנדרטיים כדי להבטיח חיטוי נאות של אזור העבודה.

זה הכל. תודה שצפיתם. היי. היי, להתראות.