RNA התערבות קרציות

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים את טכניקת השתקת RNA (RNA interference) בקרציות באמצעות הזרקה. דבר זה מושג תחילה על ידי סינתזה של RNA דו-גדילי של הגן או הגנים הרלוונטיים. לאחר מכן, ה-RNA מוזרק לקרציות, שלאחר מכן הן נשמרות בתא לחות למשך 24 שעות.

לאחר תקופת המתנה זו, הקרציות ניזונות מבעל חיים, כגון כבש. נקבעים פרמטרי האכלה כגון משקל, התקלפות ומיקום הביצים, וכן ביטוי של הגן או הגנים המבוקשים באמצעות real-time R-T-P-C-R. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המדגימות את השפעת השתקתו של הגנים המבוקשים על הביולוגיה של הקרצייה באמצעות הערכה של פרמטרים ביולוגיים של הקרצייה וביטוי גנים ב-real-time R-T-P-C-R.

הקבוצה שלנו עובדת עם קרציות בניסיון לאפיין אירועים מולקולריים בממשק שבין הקרצייה לפתוגן, על מנת להשתמש במידע בסיסי זה לפיתוח שיטות לבקרת פלישת קרציות והעברת פתוגנים לבני אדם ולבעלי חיים. השתקת RNA (RNA interference) הפכה לכלי חיוני במחקר זה מכיוון שהיא השיטה היחידה הזמינה למניפולציה גנטית של קרציות. תפקודם של גנים רבים בקרציות אינו ידוע.

השתקת RNA (RNA interference) מאפשרת לנו להגדיר את תפקידם של גנים בקרציות ואת ביטוי הגנים בהיבטים רבים של הביולוגיה של הקרציה, כולל הזדווגות, רבייה, האכלה, עיכול, תפקוד בלוטות הרוק, והכשירות של הקרציה כווקטור להעברת פתוגנים. את הפרוצדורה ידגים צוות השתקת ה-RNA בקרציות מהמעבדה שלנו, ד"ר Ed Lewin, סטודנט לתואר מתקדם, Busby ואני. כדי לייצר RNA דו-גדילי, תחילה סנתיזו פריימרים אוליגונוקלאוטידיים המכילים רצפי פרומוטור T7 עבור תמלול RNA in vitro.

לדוגמה, derma center vari lesin. השתמשו בפריימרים האוליגונוקלאוטידיים D eight A a T 75 ו-D eight DVT 73 המוצגים כאן. הגבירו את הגן המטרה באמצעות R-T-P-C-R תוך שימוש ב-10 picomoles מכל פריימר אוליגונוקלאוטידי ו-1 to 10 nanograms של RNA כולל מקרציה.

בשלב הבא, טהרו את תוצר ה-PCR. לאחר מכן, השתמשו בשמונה µL או בכ-100 ng כדי לסנתז RNA דו-גדילי. כדי להכין את הקרציות להזרקה, שטפו תחילה את הקרציות בסדרת התמיסות הבאה: מי ברז, 3% hydrogen peroxide, מים מזוקקים פעמיים, 70% ethanol ושתי שטיפות סופיות במים מזוקקים.

בצעו כל שטיפה בתוך מבחנה צנטריפוגית חד-פעמית של 50 milliliter על ידי ניעור. לאחר מכן, שפכו את התמיסה דרך רשת סריג דקה. ייבשו את הקרציות על נייר סופג, ולאחר מכן חלקו את הקרציות לקבוצות של 20 עד 50, בהתאם לניסוי.

העבירו כל קבוצה לכוס פלסטיק בנפח 1.25 ounce עם מכסה אטום, וסמנו כל כוס לפי הקבוצה הניסויית. לאחר מכן, הרכיבו צוות RNAi המורכב משלושה אנשים שיבצעו את תהליך ההזרקה. האדם הראשון ממקם כל קרציה על סרט דביק המודבק לדף שעווה דנטלית בצבע אדום בגודל של שלוש על שש אינץ'.

האדם השני מזריק לקרציות והשלישי עוקב אחר הקרציות לאחר ההזרקה, נושף פחמן דו-חמצני על הקרציות כדי להפעילן, וסופר ומעביר את הקרציות החיות לכוסות המסומנות במספר הקבוצה הניסויית. כל חברי הצוות חייבים להרכיב כפפות חד-פעמיות. כדי להתחיל בתהליך ההזרקה לקרציות, תפסו קרצייה באמצעות פינצטת Dumont עדינה והניחו אותה כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מעלה על סרט דביק כפול שהודבק ללוח שעווה דנטלית אדומה. מקמו את הקרציות בקרבה אחת לשנייה בקבוצות של חמש. הניחו רצועה קטנה של סרט דביק (masking tape) מעל חלקי הפה של כל חמש הקרציות.

כדי להגביל אותם עוד יותר, השאר את רוב הגוף חשוף כך שתהליך ההזרקה יוכל להיצפה על ידי המזריק. כדי להזריק לקרצייה, פתח חור ברביע הימני התחתון של המשטח הוונטרלי של השלד החיצוני באמצעות מזרק אינסולין חד-פעמי המצויד במחט בדרגה 29 ובאורך חצי אינץ'. לאחר מכן, הזרק באופן מיידי לקרציות 0.2 עד 0.5 µL של תמיסת RNA דו-גדילי באמצעות מזרק Hamilton בהתאמה אישית ומחט בדרגה 33 ובאורך אינץ' אחד עם קצה חתוך בזווית של 45 מעלות; הכנס את המחט עמוק לתוך חלל הקרצייה כדי להבטיח את מיקומו והשמירה של ה-RNA דו-גדילי.

על אף שנוזל משתחרר לאחר ההזרקה, מיקום עמוק של המחט להזרקה יבטיח שפיקדון מספיק של RNA דו-גדילי יועבר לחלל הקרציה כדי לגרום להשתקת גנים; יש להיזהר לא להזריק כמות מופרזת, דבר שיגרום לאובדן המולימפה ולמות הקרציה. מיד לאחר הזרקת הקרציות, הרים אותן מהסרט הדביק הכפול באמצעות פינצטה עדינה והעבר אותן למכל התאוששות מפלסטיק.

הקרציות יישארו לזמן קצר לא פעילות לאחר ההזרקה, אך אמורות להתחיל לזחול בתוך הצלחת במהרה. הפעילו את הקרציות על ידי נשיפת פחמן דו-חמצני עליהן. ברגע שהקרציות זוחלות ופעילות, פצע ההזרקה יחלים במהירות והן צפויות לשרוד.

ספרו את הקרציות בכל קבוצה ניסויית והניחו כל קבוצה בכוס פלסטיק מסומנת עם מכסה אטום. החליפו כל קרציה שמתה בקבוצה הנוכחית לפני הזרקה לקבוצה הניסויית הבאה. נקו את מזרק ההמילטון לפני ההזרקה לקבוצה הניסויית הבאה על ידי מילוי ואז ריקון של המזרק במי חמצן 3% טריים.

15 פעמים, ולאחר מכן 15 שטיפות במים סטריליים. יש להיזהר לא לכופף את הבוכנה של מזרק ההמילטון (Hamilton), שכן אחרת הבוכנה לא תנוע בצורה חלקה ולא תגיב למגע העדין הנדרש להזרקה לקרציים. לאחר ההזרקה, יש להניח את הקרציים בתא המכיל מיכל מלא במים ובאשלגן סולפט, השומר על לחות גבוהה עבורם למשך יום אחד.

בשלב הבא, מקמיים קרציות בודדות בתאי האכלה של קרציות המודבקים לכבשה, ומאפשרים להן להזין יחד עם מספר שווה של קרציות זכר או נקבה שלא הוזרקו, בהתאם למין שלא הוזרק. אספי ושקלי את קרציות הנקבה מתא ההאכלה לאחר השלמת ההזנה, הנמשכת כ-10 ימים, או כאשר נקבות הביקורת נשרו מהמארח. דגרי כל קבוצת קרציות בתא לחות עד לסיום הנחת הביצים. העריכי את הנחת הביצים לפי קבוצה על ידי שקילת מסת הביצים שהופקה על ידי כל הקרציות בקבוצה, כדי להעריך את הפנוטיפ של הקרצייה לאחר ההזנה.

קבעו את מספר הקרציות ששרדו וחשבו את משקל הקרציות, כמו גם את מיקום הביציות ואת פוריות הביצים. בהתאם לגן המטרה ומטרות המחקר, ניתן לבצע אנליזות נוספות כדי לאשר השתקה גנטית באמצעות R-T-P-C-R. לאחר ההאכלה, בצעו דיסקציה של בלוטות הרוק והמעיים מקרציות בודדות מקבוצת הביקורת המוזרקת ומקבוצת ה-RNA דו-גדילי המוזרקת, ולאחר מכן הפקו RNA כולל מדגימות הרקמה הבודדות.

נתחו את תמלילי הגן המטרה ברקמות בודדות באמצעות real-time R-T-P-C-R ונרמלו את רמות ה-RNA ביחס ל-16 s ribosomal RNA של הקרציה. באמצעות שיטת gene norm, הריצו עקומות דיסוציאציה בסוף התגובה כדי להבטיח שנוצר רק אמפליקון אחד ושהאמפליקונים עוברים דנטורציה באופן עקבי באותו טווח טמפרטורות עבור כל דגימה, השוו את ערכי ה-CT המנורמלים של רמות ה-mRNA בין קרציות שהוזרקו ביקורת לבין קרציות שהוזרק להן RNA דו-גדילי באמצעות מבחן t של Student.

הפרוטוקול המתואר כאן שימש במעבדתנו לביצוע RNAi במגוון מינים שונים של קרציות. כמות ה-RNA דו-גדילי המוזרקת לקרציות משתנה בהתאם לגודל הקרצייה. מיני קרציות גדולים יותר יכולים לקלוט נפח גדול יותר.

ניתן למצוא את המקורות בחלק הכתוב המצורף לפרוטוקול. אם הפרוטוקול בוצע נכון, שיעור התמותה כתוצאה מהליך ההזרקה לאחר 24 שעות צריך להיות נמוך מ-5%. מוצג כאן פנוטיפ טיפוסי לאחר השתקה גנטית (gene knockdown) בקרציים, כאשר קבוצת קרציים הוזרקה עם תערובות של RNA דו-גדילי ששימשו לסריקת אנטיגנים מגנים בקרציים.

בקרציים הנבדקים באמצעות מיקרוסקופיה של אור, ניתן להבחין בניוון תאי ברקמות הקרצייה. שינויים פנוטיפיים עשויים להיות מלווים גם באובדן תפקוד. לדוגמה, RNAI של SUBIN מוביל לזכרים עקרים שאינם יכולים להזדווג בהצלחה עם הנקבות בעקבות הפרעה ב-RNA ובקרציים.

ניתן להשתמש בשיטות אחרות כדי לקבוע את השפעת השתיקה הגנטית על ביטוי הגנים והחלבונים ועל הביולוגיה של הקרציה, כולל real-time R-T-P-C-R, מיקרוסקופיית אור, אלקטרונים או קונפוקלית, גנומיקה או פרוטאומיקה. ניתן לבצע השתקת RNA גם בתרביות תאים של קרציות, דבר המספק שיטה in vitro לחקר האינטראקציות בין תאי הקרציה לפתוגנים.