כלי אנליטי תיבת להערכת ביוכימיים, מבנית Transcriptome מקיף של Biofilms אוראלי בתיווך Mutans streptococci

ביופלמים המתגבשים על פני השן הם מורכבים ומובנים מאוד. אלו הן קהילות מיקרוביאליות השזורות במטריצה חוץ-תאית, החשופות לאתגרים סביבתיים מתמידים. המטרה הכללית כאן היא להציג שני רכיבים ספציפיים של ארגז כלים אנליטי שנועד להקל על מחקרים מבניים ומולקולריים, תוך התחשבות בטבעם המורכב של ביופלמים אוראליים, וזאת באמצעות שילוב של טכניקת דימוי פלואורסצנציה חדשנית עם תוכנה בהתאמה אישית לעיבוד וניתוח נתונים.

דבר זה מושג תחילה על ידי בחירה של בדיקות ספציפיות לניתוח ביופילם, טרנסקריפטום ומבנה, כולל גישה חדשה של דימות קונפוקאלי לוויזואליזציה סימולטנית של EPS וחיידקים. השלב השני של הפרוטוקול הוא איסוף הנתונים הגולמיים מהבדיקות הביולוגיות. השלב השלישי הוא עיבוד הנתונים הגולמיים באמצעות תוכנה ספציפית, כולל ה-duo stat שפותח לאחרונה לניתוח קולוקליזציה.

השלב הסופי הוא ניתוח נתוני התהליך, הכולל שימוש בתוכנה לכריית וארגון נתוני מיקרו-מערכים (microarray), data visualizer, או MDV. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות כיצד פתוגנים אוראליים משנים את התרנסקריפטום שלהם ואת ארכיטקטורת הביופילמים בתגובה לתזונה מורכבת ואינטראקציות מיקרוביאליות של המארח באמצעות ארגז הכלים האנליטי המשולב והייחודי שלנו, המספק ניתוח ביופילם ופרשנות נתונים מקיפים יותר. היי, שמי מישל קו (Michelle Kuh), פרופסור חברה במרכז לביולוגיה אוראלית כאן במרכז הרפואי של אוניברסיטת רוצ'סטר.

היום, אנו מציגים ארגז כלים אנליטי לניתוח ביופילמים. ארגז כלים זה יכול לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום חקר הביופילמים, כגון כיצד בנויים תאי הביופילם, כיצד הם מסודרים עם המטריצה החוץ-תאית וכיצד הם מגיבים לאתגרים סביבתיים מורכבים ברמה התעתוקית (Transcriptomic). שמי ז'אן, אני פוסט-דוקטורנטית במעבדתו של ד"ר Ks.

היום אני אדגים את חלק הדימוי של ארגז הכלים שלנו. שלום, אני Aise Klein, מרצה ועובדת מחקר במעבדה של Dr.Ks.

היום אציג את תוכנת ה-MDV לניתוח נתוני microray. בהליך זה, נעשה שימוש בדיסקים של hydroxy appetite מצופים ברוק כתחליפים למשטח השן עליהם גודלים ביופילמים. ראשית, הוסיפו 2.8 milliliters של מצע גידול המוחדר ב-S mutants לכל באער של פלטת 24 באערים, תוך הגנה על הפלטה מאור; הוסיפו לבאערים צבע LOR 6 47 מצומד לדקסטרין עד לריכוז סופי של one micromolar, ובצעו פיפטור מעלה ומטה מספר פעמים כדי לערבב את הצבע בתוך מצע הגידול.

בשלב הבא, בעזרת פינצטה סטרילית, טבלו ושטפו פעמיים את דיסקי ההידרוקסיאפטיט הסטריליים המצופים ברוק בתוך תמיסת AB buffer סטרילית כדי להסיר שאריות רוק או רכיבי רוק שאינם קשורים. לאחר מכן, מקמו את הדיסקים באופן אנכי במצע תרבית מועשר בצבע, תוך הבטחה שכל דיסק שקוע לחלוטין. כסו את הפלטה בנייר אלומיניום והדגרימו אותה בטמפרטורה של 37 °C בתוך אינקובטור עם 5% carbon dioxide למשך 20 שעות, כדי לאפשר את היווצרות הביופילמים ואת שילוב המרקם המסומן (conjugated texture) בתוך האקסופוליסכרידים המיוצרים על ידי התאים הבקטריאליים.

לסימון התאי הבקטריאליים תחילה, הכין פלטה של 24 בארות עם 2.8 milliliters של מי milli Q סטריליים בכל בארה. הוסף 1.5 microliters של צבע cyto nine לכל בארה עד לריכוז סופי של one micromolar והגנה על הפלטה מפני אור. לאחר שהביופילם נוצר, הוצא את הפלטה המכילה את הדיסקים מהאינקובטור.

שטפו כל דיסקה בתמיסה של 0.89% sodium chloride. לאחר מכן, העבירו אותן לצלחת חדשה המכילה את צבע ה-cyto nine. כסו את הצלחת בנייר אלומיניום והדגירו אותה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר צביעת התאים, טבול ושטוף את הביופילמים בתמיסת נתרן כלוריד כפי שבוצע קודם לכן. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, שחרר את הביופילמים מהחוט אל תוך צלחת פטרי המכילה נתרן כלוריד. עטוף את צלחת הפטרי בנייר אלומיניום.

הביופילמים מוכנים כעת להדמיה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בעזרת מיקרוסקופ קונפוקלי עם סריקה בלייזר. סרקו כל ביופילם בחמישה עד 10 מיקומים שנבחרו באופן אקראי וצרו סדרת Z בכל מיקום. כדי לאפשר שחזורים בתלת-ממד, פתחו את התמונות הקונפוקליות ועבדו אותן באמצעות תוכנת מראה.

הדמיה תלת-ממדית זו של תמונות קונפוקליות שהופקו באמצעות תוכנת Amira מראה ביופילם של מוטנטים S שנוצר על פני שטח אפתטי באמצעות הפרוצדורה שהודגמה. תאי חיידקים ומיקרו-מושבות נראים בירוק ומוטמעים במטריצת הביופילם המכילה אקסו-פוליסכרידים. באדום, ניתן להפיק תצוגת תקריב של אזור נבחר, הממחישה את הקשר המבני הספציפי בין החיידקים ל-EPS בקנה מידה מיקרוסקופי.

השתמש בתוכנית duos stat כדי לכמת את מידת הקולוקליזציה של רכיבי ביופילם נפרדים, כגון החיידקים והאקסופוליסכרידים. ראשית, הגדר את הנתיב של תוכנית ה-duo stat שפותחה לאחרונה ב-MATLAB גרסה 5.1 ופתח את תיקיות התמונות המכילות את תמונות סדרת ה-Z של שני רכיבי הביופילם. לאחר מכן, בחר שני ערוצים שישמשו לקורלציה ולניתוח.

שתי ערימות התמונות חייבות להיות בעלות גודל פיקסלים זהה בכל הממדים ומספר תמונות זהה בכל ערימה. הגדירו את ספי השחרור עבור כל ערוץ, פעלו לפי ההוראות בממשק התוכנה והזינו את הנתונים לקובץ עיבוד הנתונים לצורך ניתוח. איור זה מראה כיצד duo stack מפרש באופן כמותי את הקשר המרחבי בין חיידקים ל-DBS.

בתוך הביופילם, Duo stack מחשב את ההתפלגות האנכית של חיידקים ו-EPS מפני השטח של הדיסק ועד לשלב הנוזלי, כפי שניתן לראות כאן בקו הירוק עבור חיידקים ובקו האדום עבור EPS. המערכת מחשבת גם את הקולוקליזציה של חיידקים ו-EPS לאורך עובי הביופילם. כפי שמוצג בקו הצהוב, הנתונים מראים פרופורציות גבוהות יותר של EPS מאשר חיידקים לאורך עומק הביופילם, ומרבית התאים החיידקיים קשורים ל-EPS, במיוחד מהשכבות האמצעיות ומעלה. Duo stat עם רינדור בתלת-ממד מספק הבנה משופרת של הארגון המבני והאינטראקציה בין חיידקים ל-EPS בביופילמים.

על מנת להבטיח קבלת RNA באיכות גבוהה מביופילמים, אנו ממליצים לבצע את מיצוי ה-RNA בהתאם לפרוטוקול הספציפי לביופילמים המתואר במאמר של Curian KU שפורסם בשנת 2007. בכתב העת, נעשה שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים של analytical biochemistry להכנת CD NA microarray ולבדיקות quantitative realtime PCR. על מנת להקל על ניתוח מערכי הנתונים הגדולים הנוצרים בניסויי microarray, פיתחנו תוכנה לכריית וארגון נתונים, ה-microarray data visualizer או MDV, הזמינה באופן מקוון בכתובת www.oralgen.anl.gov.

לפני הגשת הנתונים ל-MDV, בצעו ניתוח סטטיסטי כגון paired T-test עם מודל של שונות אקראית (random variance model) באמצעות תוכנת BRB array tool הזמינה באופן מקוון, עם ערך P של 0.001 כערך סף להשוואת מחלקות. בדוגמה זו, בוצע ניתוח של s mutton's, של ביופילמים שגדלו בשלוש ריכוזי סוכר נבדלים ובארבע נקודות זמן. בוצעו השוואות זוגיות שהניבו שלושה קובצי BRB: תנאי A של 0.5%sucrose פלוס 1%starch לעומת 1%sucrose, תנאי B של 0.5%sucrose פלוס 1%starch לעומת 0.5%sucrose, ותנאי C של 0.5%sucrose לעומת 1%sucrose.

לוח זה מייצג את מספר הגנים שזוהו כמובעים באופן דיפרנציאלי בכל תנאי ובכל נקודת זמן, כפי שהוערכו באמצעות השוואת מחלקות סטנדרטית בעזרת כלי ה-BRB array, התוצאה שלהם היא מספר רב של גנים המכונים BRB raw data. לצורך הדגמת MDV, נתמקד בנקודת הזמן של 30 שעות באמצעות Excel. המירו את ה-BRB raw data לקבצי טקסט עם טאבים (tab limited) בפורמט MDV.

יש לוודא שכל האותיות המצורפות למספר הלשונית של לוקוס הגן מוסרות, לדוגמה בשם SMU dot 1432 C. מחקו את האות C, ופתחו את MDV. פתחו את תפריט הקובץ ובחרו ב-select annotation source. כאשר מופיעה תיבת דו-שיח, בחרו באפשרות flat file.

השתמשו בכפתורי הדפדוף כדי לבחור את הקבצים המכילים הערות עבור נתוני סיווג תפקודי של מסלולי מספרים של אונטולוגיה של גנים ושם הגן. עברו לתפריט "קובץ" (file) וייבאו כל אחד מהקבצים שהומרו לפורמט MDV. כל קובץ מייצג תנאי ניסויי.

השוו את הגנים המבטאים בכל תנאי ניסויי A לעומת B לעומת C. בדוגמה זו, נעשה שימוש בתכונת דיאגרמת ון. לצורך הדגמה זו, נתמקד בגנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי הקשורים באופן ייחודי להשפעות של סוכרוז ועמילן בשילוב. התכונה המבוססת על דיאגרמת ון משמשת להדמיה של מספר הגנים הייחודיים והמשותפים המבטאים תחת התנאים השונים הללו, ומסייעת לנו בזיהוי הגנים שיבחנו בניתוחים נוספים.

כאן אנו בוחרים רק את הגנים עם הביטוי הדיפרנציאלי שהם ייחודיים למצב A ו/או B, אך לא את אלו שזוהו במצב C, כפי שמוצג כאן באפור. MDV הפחית משמעותית את המספר הכולל של הגנים לניתוח, ובמקביל סינן את הגנים שאינם רלוונטיים למקרה הניסויי. מתפריט הקובץ (file), בחרו באפשרות הייצוא (export) כדי לשמור את הנתונים.

כקבצים מוגבלים בטאבים (tab limited files), ניתן לפתוח את הקבצים ב-Excel, שם ניתן לארגן את פלט הנתונים ולהמירו לתצוגות גרפיות רצויות. ארגון הנתונים ב-Excel מאפשר תצוגה גרפית של פלט ה-MDV. גרף זה מציג סקירה כללית של הביטוי הדיפרנציאלי של תתי-קבוצות פונקציונליות ייחודיות של גנים המושפעים מהשילוב של עמילן וסוכרוז בשלבים שונים של התפתחות הביופילם.

ההשפעות על הטרנסקריפטום של מוטציות S בולטות יותר ב-30 שעות לפיתוח הביופילם מאשר בנקודות זמן אחרות. התוצאות סייעו לנו לזהות במדויק תת-קבוצות פונקציונליות ספציפיות של גנים הרלוונטיות להיפותזת העבודה שלנו, תוך התחשבות בהשפעות הזמניות שהקלו על תהליך בחירת הגנים והתיקוף (validation) העוקב. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע גם שיטות ביוכימיות ופרוטאומיות כדי לענות על שאלות נוספות, כגון מהן התגובות הפיזיולוגיות והמטבוליות הספציפיות של האורגניזמים בתוך הביופילמים.

ניתוח מקיף ואינטגרטיבי שכזה יעזור ללא ספק להבין טוב יותר כיצד הביופילמים מווסתים את הפתוגניות בחלל הפה, שהיא סביבה דינמית ומורכבת ביותר. לפרטים נוספים, אנא עיינו בקובץ ה-PDF המצורף למאמר וידאו זה.