שימוש בתפוקה גבוהה במבחנה מערכת Microfluidic לפתח Biofilms Multi-מינים שבעל פה

המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור ביופילמים של רובד שיניים מייצג מבחינה קומפוזיציונית, רב-מינים. במקביל לניתוח, זה מושג על ידי יצירת מדיה מייצגת וחיסון. לאחר מכן מוחדר החיסון לשבב המיקרופלואידי לאחר דגירה של לילה, נוצר ביופילם בתוך תעלת המיקרו.

לבסוף, הביופילם נשטף ונצבע באתרו עבור שני מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי או מיקרוסקופ פלואורסצנטי אפי. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו תאי זרימה הוא שמדובר במערכת תפוקה גבוהה המאפשרת לבצע מספר ניסויים במקביל תוך שימוש בפחות חומרים וללא צורך באמצעי מעבדה מלאכותיים. להתחיל לאסוף דגימות רוק מקבוצה של חמישה מתנדבים או יותר בצינורות פלסטיק בודדים של 50 מיליליטר.

משוך את דגימות הרוק לכוס פלסטיק אחת המונחת על קרח. הימנע משימוש בכוסות זכוכית במערך זה מכיוון שביופולימרים רוק נוטים להיצמד למשטחי זכוכית. לאחר מכן, הוסף חור שלשות לדגימה עד שהריכוז הסופי שלה הוא 2.5 מילימולר.

מערבבים את התערובת במשך 10 דקות על קרח. משוך את כל התכולה למספר צינורות פלסטיק. בצע סיבוב במהירות גבוהה למשך 30 דקות בצנטריפוגה מקוררת של ארבע מעלות צלזיוס כדי להפריד חלקיקים מהדגימה.

העבירו את הרוק למיכל טרי וסטרילי והשליכו את שבר הגלולה כדי להכין מצע גידול נקי מחיידקים מהדגימה. ראשית, יש לדלל את הדגימה נטולת פסולת היום בשלושה נפחים של מים נטולי יונים. לאחר מכן באמצעות מסנן קרום קושר חלבון נמוך של 0.22 מיקרו

עקרו את הרוק תוך שמירה על החלק המסונן על קרח. רהוט את התמיסה המעוקרת ואחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס עד הצורך. אסוף דגימות רוק מקבוצה של חמישה מתנדבים או יותר בצינורות פלסטיק סטריליים של 50 מיליליטר.

משוך את דגימות הרוק לכוס פלסטיק מעוקרת מראש בטמפרטורת החדר, או לצינור של 50 מיליליטר. הוסף גליצרול מעוקר עד לקבלת גליצרול של 25%. מגיעים לתערובת רוק של 75%.

בניגוד לפרוטוקול מצע הגידול שבו הוסרו מזהמים בשלב סינון, טכניקה סטרילית חשובה כאן כדי למנוע זיהום מחיידקים או פטריות ספציפיים שאינם דרך הפה. מערבבים את תמיסת הרוק גליצרול. ובכן, יש לשים את תערובת הרוק גליצרול ולאחסן דגימות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהן נחוצות כדי להתחיל.

רכוש או יצר שבב מיקרופלואידית עם מיקרו-ערוץ דומה לאלה המוצגים כאן לפני חיסון דגימות לתוך השבב הן עבור מדיום הגידול השלילי של החיידקים והן עבור החיסון החיובי של החיידקים על הספסל בטמפרטורת החדר. מערבולת כל צינור למשך חמש שניות לערבוב לפני שתמשיך לניסוי העיקרי, התחל בהוספת 100 מיקרוליטר של מצע הגידול במאגר יציאת השבבים. באמצעות משאבת בקרה ממוחשבת התחל זרימה בינונית דרך המיקרו-ערוץ למשך שתי דקות.

בטמפרטורת החדר, בדוק ויזואלית כל תעלה כדי להבטיח מילוי נוזלים תקין. דגרו את השבב בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. זה יצפה את דפנות המיקרו-ערוצים בפיגום ביופולימרי שאליו יעגן הביופילם במהלך הצמיחה.

לאחר מכן שאב ידנית או את המדיה הנותרת ממאגר היציאה והעביר את השבר הזה, שישמש כעת כעומס איזון הידרודינמי למאגר הכניסה. לאחר שקיעת פיגום ביופולימר, הוסף 100 מיקרוליטר של החיסון החיובי של החיידקים למאגר היציאה. הנח את השבב על פלטה חמה של 37 מעלות צלזיוס והתחל בזרימה הפוכה של גזירה בינונית.

נסיעה מהיציאה למאגר הכניסה למשך שש שניות בדיוק. לאחר מכן כבה את המשאבה ודגר את השבב בתנאים סטטיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות כדי להקל על הצמדת חיידקים או פטריות לדפנות הצד של המיקרו-ערוץ. לאחר מכן, הסר והשליך את כל החיסון ממאגר היציאה בעזרת פיפטה ומלא מחדש את אותו מאגר על ידי הוספת מיליליטר אחד של מדיום גידול ללא חיידקים.

דגרו את השבב בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך כ-20 שעות בזרימה נמוכה כדי לקדם צמיחת ביופילם תוך-ערוצי. פיפטה החוצה את כל הפתרונות ממאגרי הכניסה והיציאה. מרחו 100 מיקרוליטר PBS במאגר הכניסה ושטפו את תעלת המיקרו למשך 20 דקות.

תחת זרימה נמוכה קדימה מהכניסה ליציאה, הביופילם מוכן כעת להכתמה מתה. רגע לפני צביעת ביופילם, הכינו 100 מיקרוליטר מתערובת הצביעה הכדאית כפי שנמצא בפרוטוקול הטקסט עבור כל ערוץ שיש לצבוע. הגן על תמיסה זו מפני חשיפה לאור עד שיהיה צורך להכתים את הביופילם, לשאוב את כל הנוזלים שנותרו מהכניסה ולמלא מחדש את אותו מאגר ב-100 מיקרוליטר מתערובת הצביעה הכדאיות.

לאחר מכן דחף את תמיסת הצביעה דרך המיקרו-ערוץ למשך 45 דקות. תחת זרימת שיתוף נמוכה בטמפרטורת החדר, הקפד להגן על השבב מפני חשיפה לאור. שאפו את כל הנוזלים שנותרו ממאגר הכניסה ומלאו מחדש ב -100 מיקרוליטר PBS.

שטפו את המיקרו-ערוץ למשך 20 דקות תחת זרימת נתח נמוכה בטמפרטורת החדר כדי להסיר עודפי צבעים לא קשורים. הביופילם המוכתם מוכן כעת למיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לבחון את הארכיטקטורה התלת-ממדית של הביופילמים. ניתן להשתמש בשחזורים דיגיטליים באמצעות סריקות אופקיות עם מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לצפות במבנה הסרט הכללי מכל זווית אלכסונית.

יתר על כן, ניתן ליישם ניתוח צביעה של מתים חיים על אותו מערך נתונים כדי לחקור את התלות המרחבית של כדאיות התא בתוך הביופילם כפונקציה של טיפולים כימיים שונים. לאחר הדמיית הביופילם, ניתן לחלץ תאים מתעלות לא מוכתמות. באמצעות מים מזוקקים הפועלים בזרימת גזירה גבוהה, ניתן לזהות את פלורת הביופילם מה-DNA הגנומי על ידי ריצוף 4 5 4 pyro.

בצע הליך זה. שיטות אחרות כמו הוספת מינים או תרכובות שונות יכולות להתבצע במטרה לענות על שאלות שונות, כמו למשל מה קורה לביופילמים הרב-מינים בתנאים שונים.