Microfluidic מבוססי הידרודינמית מלכודת חלקיקים יחיד
21 בינואר 2011
במאמר זה, אנו מציגים שיטה microfluidic מבוסס על הכליאה החלקיקים מבוסס על זרימה הידרודינמית. אנו מדגימים לכידה חלקיק יציב בנקודה נוזל הקיפאון באמצעות מנגנון בקרה ומשוב, ובכך מאפשרים כליאה ו המיקרומניפולציה של חלקיקים שרירותי microdevice משולבת.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לכלוא ולתמרן חלקיקים בודדים במיקרו- ובננו-קנה מידה באמצעות זרימה למינרית במכשיר מיקרופלואידי. המלכודת ההידרודינמית מורכבת ממכשיר מיקרופלואידי בעל גיאומטריה של תעלת חריץ צולבת, היוצרת זרימה עם נקודת קיפאון בצומת המיקרו-תעלה. שסתום מובנה על השבב הממוקם באחד מתעלות היציאה משמש לשליטה פעילה בזרימת הנוזל וללכידת חלקיקים.
חלקיקים מוגבלים לנקודת ייחוס המוגדרת על ידי המשתמש באמצעות בקרה פעילה של מיקום נקודת הסטגנציה. בקר משוב משמש למעקב אחר מיקום החלקיק ולויסות השסתום שבשבב כדי לשמור על מיקום החלקיק בנקודת הייחוס. באמצעות המלכודת ההידרודינמית, חלקיקים בודדים נלכדים בתמיסות חלקיקים מהולות או מרוכזות, וניתן לדמותם באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה או שדה בהיר.
חלקיק בודד עשוי להיות כלוא בטווח של מיקרון אחד ממרכז המלכודת, כפי שמוצג במסלול החלקיק ובהיסטוגרמה של התזוזה של החלקיק ממרכז המלכודת. שלום, אני אריק ג'ונסון ריו מהמעבדה של פרופסור צ'ארלס שרואר במחלקה להנדסה כימית וביומולקולרית, ובמרכז לביופיזיקה וביולוגיה חישובית כאן באוניברסיטת אילינוי. שלום, שמי ארי, חוקר פוסט-דוקטורט במעבדת שרודר.
שלום, אני שריל שרודר, והיום נראה לכם כיצד לייצר ולהטמיע התקן מיקרופלואידי ללכידה הידרודינמית של חלקיקים בודדים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מלכודות אופטיות או אלקטרו-קינטיות, הוא שהלכידה ההידרודינמית מושגת באמצעות פעולתו הבלעדית של זרימת נוזלים, ובכך היא מבטלת שדות כוח שעלולים להשפיע על לכידת ננו-חלקיקים או תאים. לטכניקה זו יש פוטנציאל לשנות את המדע הבסיסי והיישומי על ידי מתן אפשרות ללכידה בתמיסה חופשית של חלקיקים בקנה מידה מיקרוסקופי וננוסקופי, ללא דרישות לגבי התכונות הכימיות או הפיזיקליות של החלקיק הנלכד.
בואו נתחיל. כדי להקל על קילוף השכבות מהתבניות של ה-SU-8, יש לייבש את פני השטח של תבניות ה-SU-8 על ידי הנחת הפרוסות (wafers) בכלי ייבוש (desiccator) תחת ואקום למשך 10 דקות, עם צלחת זכוכית המכילה מספר טיפות של trichloroethylene, תוך שימוש ב-PDMS של mixed and DGAs עבור השכבות הפלואידיות ושכבות הבקרה. בצעו ציפוי ספין (spin coat) של תערובת PDMS ביחס של 15:1 על תבנית השכבה הפלואידית למשך 30 שניות במהירות של 750 RPM, ולאחר מכן הניחו את הפרוסה בתוך צלחת פטרי.
באופן דומה, הניחו את תבנית שכבת הבקרה בתוך צלחת פטרי ומזגו על התבנית תערובת PDMS ביחס של חמישה לאחד עד לעובי של 4 mm. כדי לבצע פולימריזציה חלקית של שכבות ה-PDMS, אפו את הפרוסות/PDMS למשך 30 דקות בטמפרטורה של 70 °C והמתינו לקירורם לטמפרטורת החדר. חתכו את העתק ה-PDMS באמצעות סקלפל וקלפו אותו מתבנית ה-SU-8.
לאחר מכן, באמצעות מחט בכיול 21 gauge, נקבו חור ב-PDMS שישמש כנקודת גישה למיקרו-תעלה אשר תתפקד כשסתומי ממברנה על השבב. הניחו את שכבת ה-PDMS המשוכפלת עם שכבת הבקרה על גבי פרוסת הסיליקון (wafer) עם שכבת ה-PDMS הפלואידית ששוקרה בשיטת spin coating. יישרו וחתמו בזהירות את שכבת הבקרה לשכבה הפלואידית באמצעות מיקרוסקופ סטריאו.
יש לוודא שכל בועות האוויר בין השכבות הוסרו ולהבקיע בטמפרטורה של 70 °C למשך הלילה כדי להבטיח פולימריזציה מלאה של שתי השכבות ללוח PDMS מונוליתי עם שתי שכבות; לאחר קירור לטמפרטורת החדר, השתמש בסכין מנתח כדי לחתוך ולקלף את רפליקת ה-PDMS מתבנית ה-SU-8, והשתמש בלהב תער כדי להסיר עודפי PDMS ולהפריד בין כל יחידה של ההתקן. כעת, בצע חורים בנקיבות הגישה לערוצים המיקרופלואידיים בשכבת הנוזלים באמצעות מחט במידה 21 gauge. נקה כיסוי זכוכית (cover slip) באמצעות אצטון ו-IPA וייבש בעזרת חנקן.
טפלו הן בזכוכית המכסה (cover slip) והן במשטחי העתק ה-PDMS באמצעות פלזמה של חמצן בלחץ של 500 millitorr למשך 30 שניות. לאחר מכן, הבאי את שני המשטחים למגע מיידי כדי ליצור אטימה בלתי הפיכה. לבסוף, אפו את ההתקנים למשך הלילה כדי להגביר את ההידבקות בין שכבות ה-PDMS לבין זכוכית המכסה.
ראשית, הנח את ההתקן המיקרופלואידי על הבמה של מיקרוסקופ הפוך ואבטח אותו באמצעות תפסני הבמה. לאחר מכן, כדי להזרים את התמיסות אל ההתקן המיקרופלואידי, מלא מזרק אטום לגז של 1 mL ומזרק אטום לגז של 250 µL בתמיסת בופר ובתמיסת דגימה, בהתאמה. השתמש בשסתומי T בין מזרק הדגימה לבין פתח הדגימה בהתקן המיקרופלואידי כדי לשלוט בהזרמת הדגימה.
כעת צרו את החיבורים הפלואידיים בין המזרקים למכשיר המיקרופלואידי, באמצעות צינוריות per fluoro oxy, מתאמי lure lock וצינוריות מתכת במידה 24 gauge. לאחר מכן, צרו את החיבורים הפלואידיים עבור תעלות היציאה במכשיר המיקרופלואידי באמצעות צינוריות PFA וצינוריות מתכת במידה 24 gauge. כדי לשמור על מפל לחץ קבוע בין המזרקים לתעלות היציאה, יש להשתמש בצינוריות PFA באורך שווה עבור היציאות, כאשר שתיהן טבולות בתוך מבחנת צנטריפוגה של 1.5 milliliter המולאה בתמיסת בופר.
מלאו את השסתום שבשב בשמן נשיאה פלואורי באמצעות מזרק פלסטיק של 3 mL עם חיבור lure lock, כדי למנוע דליפת אוויר לשכבה הפלואידית במהלך הפעולה. דחפו את האוויר שבתוך תא השסתום דרך ממב्राट ה-PDMS אל תוך המיקרו-תעלה בשכבה הפלואידית.
להפעלת השסתומים על השבב. חברו אספקת גז אינרטי תחת לחץ לפתח שבשכבת הבקרה. שטפו את החיבורים הפלואידיים ואת ההתקן המיקרופלואידי ב-0.5 milliliters של תמיסת בופר כדי להבטיח שכל בועות האוויר הוסרו מהמערכת, כולל מערוצי היציאה.
קצבי זרימה טיפוסיים המשמשים לסילוק בועות נעים בין 2000 ל-5,000 µL/h. לאחר שבועות האוויר נשטפו מהערוצים המיקרופלואידיים, הפחית את קצב הזרימה ל-50 עד 100 µL/h, שזהו קצב זרימה נפחי טיפוסי ללכידת חלקיקים. כעת העבר את שסתומי ה-T כדי לאפשר לדגימה לזרום אל תוך ההתקן המיקרופלואידי. הפעל את קוד ה-LabVIEW שנבנה במיוחד, אשר מבצע אוטומציה של לכידת החלקיקים באמצעות יישום של אלגוריתם בקרת משוב ליניארית.
הקוד לוקט תמונות ממצלמת CCD ומעביר פוטנציאל חשמלי לווסת לחץ המבצע מודולציה אקטיבית של מיקומו של שסתום פנאומטי על השבב. באמצעות במת ההזזה XY של המיקרוסקופ, מקמו את אזור הלכידה במרכז שדה הראייה של המצלמה. הביאו את אזור הלכידה למיקוד של עדשת העדשה וכווננו את הגדרות המצלמה כדי לייעל את תנאי הדימות.
בחרו אזור עניין (ROI) מלבני בתוך שדה הראייה של המצלמה, כך שמרכז ה-ROI יהיה מיקומו של מרכז המלכודת. כעת, הגדירו את לחץ ההיסט (offset pressure) המופעל על השסתום המובנה בשבב. צמצום ברוחב 100 עד 200 מיקרון הממוקם בתעלת היציאה הנגדית.
מספק לחץ היסט (offset pressure) להפעלת השסתום המובנה על השבב. הפעל את בקר המשוב וכייל את ההגבר הפרופורציונלי (proportional gain) כדי למקסם את תגובת המלכודת. בהתאם לקצב הזרימה ולמיקום השסתום על השבב, קיים ערך הגבר פרופורציונלי אופטימלי, אשר מגביר את יציבות המלכודת ומבטל תנודות לא רצויות של החלקיקים.
קוד ה-LabVIEW ילכוד באופן אוטומטי את אחד החלקיקים הנכנסים לאזור הלכידה. בסרטון זה, תנועת החלקיקים בכיוון הזרימה נגרמת מכך שזרם כניסת הדגימה נשאר פתוח כדי למקסם את הדחיסות של הלכידה בכיוון הזרימה. המשתמש יכול לסגור את זרם הדגימה במהלך הלכידה, פעולה המאזנת את הזרימה באופן שווה לצומת הערוץ הרוחבי, לנטר את החלקיק הלכוד ולשמור על מיקוד החלקיק במישור התמונה באמצעות מיקוד ידני או מערכת מיקרוסקופ בעלת מיקוד אוטומטי.
ההתקן המיקרופלואידי המשולב מורכב ממיקוד דגימה, צומת חריץ צולב ושסתום פניומטי; הלכידה מתרחשת בצומת החריץ הצולב ומיקום החלקיק נשלט על ידי כוונון פעיל של שדה הזרימה בצומת המיקרוערוץ באמצעות השסתום הפניומטי. כאן, מוצגת תמונה של חריזה בודדת המוגבלת בתוך המלכודת ההידרודינמית. בנוסף לחריזה במרכז המלכודת, מוצגות מספר חריזות שאינן לוכדות באזור הלכידה בצומת החריץ הצולב.
מסלולו של חלקיק פוליסטירן פלואורסצנטי לכוד בגודל 2.2 micron ממופה. החלקיק נלכד בתחילה למשך שלוש דקות. לאחר מכן הוא משוחרר מהמלכוד ונמלט דרך אחד מתעלות המוצא.
היסטוגרמה של הסטה של חבב כלוא ממרכז המלכודת לאורך כיוון ערוצי היציאה מעידה על כך שהחלקיק מוגבל למרחק של מיקרון אחד ממרכז המלכודת. היום, הצגנו את מלכודת ה-EM כשיטה ללכידה בתמיסה חופשית של חלקיקים במיקרו ובננו-סקייל באמצעות זרימת נקודת צמצום הנוצרת בתוך התקן מיקרופלואידי. לכידה הידרודינמית מאפשרת כליאה של חלקיק מטרה בודד בתליות חלקיקים ריכוזיות, דבר המהווה קושי בשימוש בשיטות לכידה חלופיות המבוססות על שדות כוח.
לאחר פיתוח נוסף, טכניקה חדשה זו תאפשר מחקר מדעי בתחומי הביופיזיקה, מכניקת התא, דינמיקת נוזלים, אנזימולוגיה וביולוגיה של מערכות. תודה שצפיתם, ואנו מקווים שטכניקה זו תועיל לניסוייכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה מבוססת מיקרופלואידיקה לכליאה ומניפולציה של חלקיקים במיקרו ובננו-סקאל באמצעות זרימה הידרודינמית. מנגנון בקרת משוב מיושם כדי להשיג לכידה יציבה של חלקיקים בנקודת קיפאון של נוזל בתוך התקן מיקרופלואידי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מיקרופלואידיקה
- מניפולציה של חלקיקים
- לכידה הידרודינמית
רקע
- התקני מיקרופלואידיקה מאפשרים בקרה מדויקת של זרימת נוזלים.
- מלכודות הידרודינמיות יכולות לכלוא חלקיקים במיקומים ספציפיים.
- מנגנוני בקרה פעילים משפרים את יכולות המניפולציה של חלקיקים.
- ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובמיקרוסקופיה בשדה בהיר לצילום חלקיקים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה ללכידת חלקיקים בודדים במכשירים מיקרופלואידיים.
- ניצול זרימה למינרית לצורך כליאת חלקיקים יעילה.
- יישום בקרת משוב לשמירה על מיקום החלקיק.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- התקן מיקרופלואידי בעל גאומטריה של תעלת חריץ צולב.
- שסתום על השבב (On-chip valve) לבקרה אקטיבית של זרימת הנוזלים.
- בקר משוב למעקב אחר מיקום החלקיקים וויסותו.
- טכניקות דימוי כגון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובשדה בהיר.
תוצאות עיקריות
- לכידה מוצלחת של חלקיקים בודדים הן בתמיסות מדוללות והן בתמיסות מרוכזות.
- יציבות מוכחת של כליאת החלקיקים בנקודת עבודה (set point) המוגדרת על ידי המשתמש.
- בקרה יעילה של מיקום נקודת הקיפאון (stagnation point) באמצעות בקרת משוב.
- יכולת לדימות של חלקיקים לכודים באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה.
מסקנות
- השיטה מספקת גישה חסונה למניפולציה של חלקיקים במערכות מיקרופלואידיות.
- מנגנוני בקרה אקטיביים משפרים את הדיוק של לכידת החלקיקים.
- ניתן ליישם טכניקה זו בתחומים שונים הדורשים כליאת חלקיקים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מלכודת הידרודינמית מיקרופלואידית זו מאפשרת כליאה ללא סימון וללא שדה של חלקיקים בודדים במיקרו- ובננו-קנה מידה בתליות ביולוגיות מורכבות, ותומכת בתיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים על ידי מתן אפשרות לצפייה ישירה בהתנהגות החלקיקים ללא קיבוע לפני השטח או שדות המפריעים למערכת. השיטה מספקת בקרה מרחבית כמותית ויציבות לטווח ארוך לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים באינטראקציות בין ננו-חלקיקים לביומולקולות בתהליכי גילוי. התאימות שלה לדגימות מרוכזות ולסוגי חלקיקים שונים מגבירה את הרלוונטיות התרגומית לסריקה פרה-קלינית של נשאי תרופות ושל שלפוחיות חוץ-תאיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות לכידת חלקיקים בודדים בתמיסה חופשית, כדי לצפות באינטראקציות במצבם הטבעי ללא ארטיפקטים של שדות אופטיים, מגנטיים או חשמליים.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף תפקודי של מטרות בסביבות צפופות, כגון סרום או ליזטים של תאים, שבהן לכידה קונבנציונלית נכשלת עקב הפרעות רקע.
- ערך חיזוי: מקל על זיהוי מובילים (lead identification) על ידי מתן אפשרות לתצפית ממושכת בדינמיקת החלקיקים, כדי להעריך את קינטיקת הקישור והיציבות בתנאים קרובים לתנאים פיזיולוגיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מכינה מערכות חלקיקים שעברו ולידציה עבור תהליכי עבודה המשכיים, על ידי מתן אפשרות לבידוד ומניפולציה של ישויות בודדות מתוך אוכלוסיות הטרוגניות.
- פלט כמותי: מייצרת היסטוגרמות העתקה ונתוני מסלול המשמשים כמדדים הניתנים לשחזור להשוואת התנהגות חלקיקים בתנאים שונים.
- סקילביליות של הפלטפורמה: משתלבת עם התקני מיקרופלואידיקה קיימים באמצעות שסתומים פנאומטיים על השבב, מה שמאפשר שימוש חוזר על פני מספר מטרות ומגדיל את התפוקה במערכי סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: שומר על המשכיות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי לכידת חלקיקים במטריצות רלוונטיות ביולוגית ללא שינוי של הכימיה של הפני השטח.
- קידום מותאם סיכון: מאפשר הפחתת סיכונים מכניסטית של פורמולציות של ננו-חלקיקים על ידי כימות יציבות הכליאה כמדד לעמידות קולואידית בנוזלים מורכבים.
- הלימה לסמנים ביולוגיים: תומך במחקרי סמנים ביולוגיים תרגומיים על ידי התרת תצפית ארוכת טווח של וסיקולות חוץ-תאיות בודדות או ננו-חלקיקים ליפידיים בנוזלים ביולוגיים לא מדוללים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה דרך זיהוי המולקולה המובילה ועד להערכה פרה-קלינית, במיוחד עבור מחקרים הדורשים ניתוח חלקיקים ללא הפרעה בסביבות טבעיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבחינת השערות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה ישירה של אינטראקציות של חלקיק בודד בתמיסה ללא סימונים או קישור לפני השטח.
- סריקה: משפרת את השחזוריות של הבדיקה באמצעות בקרת זרימה אקטיבית השומרת על תנאי לכידה עקביים לאורך הרצות שונות, ובכך מפחיתה שונות בבדיקות מבוססות חלקיקים.
- אנליטיקה: מספקת מעקב אחר המרכז (centroid) ומדידות הסטה כנתונים כמותיים להשוואת תגובות חלקיקים תחת תנאי באפר או ליגנד שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר לעבודה פרה-קלינית על ידי מתן אפשרות להערכת התנהגות חלקיקים בנוזלים ביולוגיים ריכוזיים המדמים תנאי in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כמודול לכידה מודולרי שניתן לשלב בפלטפורמות מיקרופלואידיות שונות, ובכך מפחית עלויות פיתוח חוזרות בין פרויקטים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי על ידי ביטול ארטיפקטים הנגרמים מהשדה ומאפשר תצפית על מצבים טבעיים של חלקיקים בתליה.
- ערך תפעולי: מספק סטנדרטיזציה ושחזור באמצעות מיקום נקודת קיבעון (stagnation point) הנשלטת על ידי משוב, מה שמבטיח ביצועי מלכודת עקביים בין משתמשים ומפגשים שונים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי אספקת נתונים כמותיים מוקדמים על יציבות חלקיקים ונטייה לאינטראקציה במטריצות ריאליסטיות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם-סיכון של מועמדים לננו-חלקיקים או וזיקולות, בהתבסס על יציבות לכידה של חלקיק בודד בנוזלים מורכבים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור מיקרופלואידי, מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ומערכות בקרה עם משוב, כגון עיבוד תמונה וויסות לחץ מבוססי LabVIEW.
- תלוי בוויסות לחץ פנומטי, שסתומים על השבב ותשתית דימוי במהירות גבוהה למעקב בזמן אמת אחר חלקיקים ולהתאמת הזרימה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי כיול השסתומים ופרמטרי מעקב אחר חלקיקים כדי להבטיח שחזוריות בין מעבדות.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום על חלקיקים שאינם כדוריים או חלקיקים ניתנים לעיוות, שכן יעילות הלכידה עשויה להשתנות בהתאם לצורה ולגודל תחת זרימה מתוחה (extensional flow).
- כולל מגבלות מעשיות כגון הצורך בפלואורסצנציה של החלקיקים או בניגודיות (contrast) למעקב אמין, וסחף פוטנציאלי במהלך הרצות ממושכות הדורש כיול מחדש תקופתי.
