תא לכידת באמצעות מכשיר microfluidic

המכשירים כפי שהכנו אותם, ארוזים בערכות של 10 או 20, וכאשר הם מגיעים, הם נשלחים בקירור בתוך קופסה והערכה מכילה את כל הרכיבים הדרושים להרצת הניסוי. בערכה ישנה חבילה עם כל המזרקים והבופרים, שיכולים להישאר בטמפרטורת החדר. כמו כן, מצורף עותק של הפרוטוקול שבו ננקוט בניסוי זה.

ישנה גם קופסה מקוררת, המכילה את המכשירים עצמם ואת כל תמיסורי ההרצה שנדרשת קירור עבורם. בדרך כלל, הערכות ארוזות בקבוצות של 10 או 20. כאשר אינן בשימוש, יש לשמור את הערכות בקירור.

כל מזרק וכל רכיב בערכה מסומנים בקפידה, והתוויות תואמות לטבלה בפרוטוקול שבו אנו פועלים. כך שאין עמימות לגבי המזרק או רכיב הערכה שיש להשתמש בהם בשלבים הבודדים. לאחר פתיחת המכשירים והנחתם בתוך קבינה לבטיחות ביולוגית, נבצע את הליך בידוד הנויטרופילים וליזתם עבור יישומים גנומיים המשכיים, כיוון שהליזאט שנקבל ישמש לבידוד, או שנחלץ ממנו את ה-RNA.

בשל כך, עלינו לוודא שהאזור שלנו נקי, לא רק במובן הסטרילי, אלא גם נקי מכל ה-RNAs שנמצאים בדרך כלל בסביבה. לכן, חשוב מאוד לנגב את כל השטח ואת המכשירים שלכם בתמיסה המשמידה RNAs. בדרך כלל, ננגב את כל הכלים ואת משטחי העבודה שלנו באמצעות RNA SAP או RNAs away, שניתן להשיג ממספר יצרנים.

המכשיר מגיע ארוז בתוך נרתיק עם סגירה תרמית. כל מכשיר הוא אטום ומזוהה באמצעות ברקוד זה. עליכם לרשום את הברקוד אם אתם עובדים עם דגימות קליניות.

כעת המכשיר אינו אטום, המכסה הוסר והוא מונח במכשיר סבב ההחזקה של המשאבה. דגימת הדם שבה אנו משתמשים היא דגימה של דם מלא. נזרים אותה דרך מזרקת BD סטנדרטית של 1 ml, ומזרקה זו מסומנת כמזרקה 1.

בדרך כלל, מוציאים את המזרק מהאריזה ומסירים בזהירות את הפקק מנבובת הדם. לאחר מכן, שואבים 700 µL או 0.7 mL של דם, ומזריקים מחצית מכמות זו, כלומר 350 µL, לתוך מבחנה של 1.5 mL. באופן זה, ניתן להעביר את הדם לעיבוד נוסף.

ניתן להעביר את מבחנת הדם שלך, ועדיין יישאר לך דם נוסף במקרה של כשל במכשיר. כעת, נטען את המזרק המכיל את הדם על המחט הזו, המחוברת לקטע צינור עם המכשיר הזה. עלינו להיות זהירים מאוד עם מכשיר הבידוד המיקרופלואידי.

עלינו להיזהר מאוד שלא להחדיר בועות אוויר לתוך המכשיר, שכן הדבר יגרום לתפקוד לקוי של המכשיר. לכן, בדרך כלל אנו לוקחים את המזרק, לוחצים על הבוכנה ומוסיפים את הנוזל למשטח העליון של המכשיר, ומוודאים שהוא רטוב לחלוטין לפני שריקנו את כל הנוזל. אנו עוצרים ומסירים בזהירות את גוף המזרק מהמחט, וממלאים את קצה המחט או את מחבר ה-lure של המחט עם שארית התמיכה שנשארה במזרק זה.

אנו נפקיע זאת. לאחר מכן, ניקח את המזרק עם הדם ונחדיר אותו לתוך חיבור ה-lure. יש להיזהר לא לשפוך את הדם ולהקפיד לא להכניס בועות אוויר.

מומלץ להשתמש בנייר סופג להחזקת גוף המזרק והצינור למקרה שיישפך דם. לאחר חיבור המזרק למעטפת הצינור או למחט, נקיש עליו מספר פעמים בחוזקה כדי להוציא בועות אוויר שעלולות להימצא במחבר. לאחר מכן, נטען את המזרק למשאבת המזרקים ונאבטח אותו באמצעות בורג הנעילה.

משאבת המזרקים מופעלת וכבר הוגדרו בה תנאי הזרימה שלנו. נזרים את הדם הזה דרך המכשיר בקצב של 30 µL לדקה. לאחר טעינת גוף המזרק אל משאבת המזרקים, נלחץ את הכפתור על זרוע הבוכנה הניידת ונחליק אותה למטה עד שתגע בחלק העליון של הבוכנה ותתחיל לדחוף נוזל החוצה דרך הקצה שלה.

זוהי מחט מפלדת אל-חלד בעלת קצה קהה. לאחר שנוודא שהמערכת מוכנה (primed), נלחץ על run. כדי להתחיל את זרימת הדם, יש ללחוץ על stop כדי לעצור אותה, ואז לקחת מבחנת צנטריפוגה נקייה של 1.5 mil או מבחנת fendor, ולנתק את החיבור בזהירות.

נתק רק צינור אחד, נתק את הצינור מאחד הפתחים של המכשיר. ברגע שצינור זה ינותק, נכניס אותו לשפופרת פנדור בנפח 1.5 mil. נלחץ על run כדי להתחיל שוב את זרימת הדם.

וכאשר אנו רואים טיפת דם נוצרת, אנו עוצרים את המשאבה ומכניסים אותה אל פתח הכניסה שפתחנו הרגע במכשיר. נלחץ על run כדי להתחיל את זרימת הדם ונפעיל טיימר לחמש דקות. עלינו לוודא שהדם ממלא באופן שווה את כל התאים ושאין בועות אוויר ניכרות במכשיר.

אם ישנן בועות אוויר החוסמות את הזרימה לכל אחת מהתאים, ניתן להשתמש בפינצטה ולהעביר אותה לאורך התעלות הקטנות המובילות לתאי הלכידה או התעלות הקטנות שיוצאות מהם. המכשיר מתמלא בצורה טובה, לכן לאחר חמש דקות, לחצו על כפתור העצירה במזרק המכני כדי להפסיק את זרימת הדם, שחררו את תפס המזרק והוציאו אותו מתושבתו במזרק המכני. לאחר מכן נשתמש במזרק מספר שלוש, הטעון ב-PBS נקי מנוקלאז. אנחנו נשתמש בו כדי לוודא שוב שפני השטח של המכשיר רטובים למניעת בועות אוויר, ונקיש על המזרק כדי לוודא שכל בועות האוויר נמצאות בחלק העליון של גוף המזרק.

שחררו את הזרוע במשאבת המזרקים והכניסו את המזרק בנפח שלושה מיליליטר למשאבה. הדקו אותה ולאחר מכן דחפו את הבוכנה מטה עד שתבוא במגע עם בוכנת המזרק. נלחץ על run ונמתין עד שהנוזל ימלא את המכשיר (prime) ועד שנראה טיפה בקצה מחט הפלדה שאינה מחלידה.

כאשר נראה טיפה שנוצרת, נעצור את המשאבה. נוציא את הדם, את קצה הפלדה הנירוסטה שבו נמצא הדם. נכניס את תחלול השטיפה (wash buffer) ונלחץ על run.

נשאיר את התהליך פועל למשך חמש דקות. יש להשתמש בניגון נקי כדי לנגב כל כמות קטנה של דם שעלולה להימצא בכניסה או ביציאה. לאחר חמש דקות של העברת בופר שטיפה דרך המכשיר, המכשיר אמור להיות נקי לחלוטין מדם, וניתן לראות זאת בכך שלא יישאר דם אדום במכשיר והוא ייראה שקוף. לכן, לאחר חמש הדקות, נספיק את זרימת בופר השטיפה.

שוב, נסיר את המזרק ממשאבת המזרקים. נסגור את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 mil, ישירות על צינור היציאה הגמיש. לאחר מכן, נרים בזהירות את המבחנה, את מבחנת המיקרו-צנטריפוגה, תוך שבירת צינור הפסולת מהמכשיר.

נשליך זאת לתוך מיכל פסחאות ביולוגיות. בערכה יש צינור יציאה חדש, העשוי למעשה מטפלון. גם לו יש קצה מפלדת אל-חלד.

אנו נחליף את צינור היציאה הישן בצינור יציאה חדש זה. ניקח את צינור היציאה וננסה לכופף אותו לצורה של U או V. כמו כן, הערכה כוללת עמודת kaya shredder, הגוזרת את ה-DNA ובשורה בסיסית מבצעת הומוגניזציה של תרחיף התאים שלכם.

כעת נפתח את הפקק הסגול של עמודת ה-shredder ונניח את צינור היציאה לתוך עמודת ה-Kay Shredder. נוציא מהערכה את מזרק מספר 2, שכתוב עליו שיועד ל-RLT; נשתמש בו כעת. זהו מזרק סטנדרטי של BD בנפח 1 ml עם מחט קהה בכיול 22 gauge, עשויה פלדת אל חלון.

נשתמש בכך כדי להזריק 350 µL של תמיסת RLT סטנדרטית מ-kyogen אל תוך המכשיר. מכיוון שלמכשיר יש נפח מת שנע סביב 50 µL, ברצוננו להזריק את ה-RLT, אך מאחוריו נרצה להזריק בועת אוויר כדי לשחרר את נפח המת של המכשיר אל תוך עמודת ה-chi shredder. נבצע זאת כך: נשתמש במזרק, נשאב 350 µL של אוויר ולאחריהם 350 µL או 0.35 ml של RLT, כך שה-RLT נמצא כעת בתחתית המזרק.

הימנעו מהפיתוי להפוך את המזרק ולהזריק את האוויר. האוויר נועד להבטיח שכל ה-RLT יעבור לתוך עמודת ה-Kay shredder. כעת נוציא את הצינורית מתוך בופר השטיפה.

נכניס את המזרק עם ה-RLT ונזריק את ה-RLT לאט למכשיר במשך כ-30 שניות, תוך וידוא שצינור היציאה פולט את הפסולת לתוך עמודת ה-chi shredder. ברגע שאוויר מתחיל להיזרק למכשיר, נלחץ את הבוכנה ונמתין עד שכל הנוזל ישוחרר לעמודת ה-Kay Shredder. נסיר את עמודת ה-kay shredder ונסבב אותה במיקרוצנטריפוגה מאוזנת במהירות של 15,000 RPM או במהירות המקסימלית של מיקרוצנטריפוגה שולחנית למשך שתי דקות.

לאחר סבוב של העמודה במשך שתי דקות, נוציא ממנה את הדגימה, שנמצאת כעת ב-RLT, ונניח אותה באחד מנבובות הקריו עם הפקק הסגול שסופקו. אם אתם עובדים עם דגימה קלינית, סימנו את נבובות הקריו הללו כבר בתחילת הניסוי. כאן נמצא הליזט בנבובת הקריו.

מבחנה זו להקפאה מוכנסת מיד למקפיא של 80°C- ונשמרת לצורך משלוח או להפקת RNA מאוחרת יותר. זהו פרוטוקול חלופי לבידוד נויטרופילים. במקום ללעס את התאים באמצעות בופר RLT, נצבע אותם בצבע היסטולוגי סטנדרטי.

צביעה. אם כן, אנו מוציאים את המכשיר האטום מהשקית ופותחים את עטיפתו, רושמים את מספר האצווה (lot number) המופיע על המכשיר ומניחים את פטריית הפטרי בתוך מחזיק פטריות הפטרי.

ניקח את מזרק ה-1 ml משקיתו, מזרק מספר 1, נטען בו 700 µL של דם ונזריק מחצית מהכמות, 350 µL, לתוך מבחנה של eend DPH. נניח אותה בצד. ניקח את מזרק מספר 4, הכולל את הצינורית שבאמצעותה נבצע את הברירה, ונזריק את הדם אל תוך המכשיר.

יש להחזיק את בסיס המחט מקצה הפיתול באופן כימי. יש להסיר את גוף המזרק ולמלא את ה-lure. המתאם ישמש לבלימה ולסילוק של מזרק זה.

נחבר את המזרק המכיל את הדם למחט, תוך שימוש במטלית ניגוב כימית (chem wipe) לאיסוף של שאריות דם שעלולות לדלוף. נקיש על המזרק כדי להסיר בועות אוויר בחיבור שבין המחט לגוף המזרק. נטען את המזרק למשאבת המזרקים, ונבצע ה priming של צינורות ההובלה על ידי לחיצה על הזרוע הנעה של משאבת המזרקים.

ננתק את הצינורית מאחד מפתחי המכשיר, מכשיר הלכידה, ונניח אותה בתוך מבחנה מסוג Eppendorf של 1.5 ml. לאחר מכן, נתחיל להזרים דם על ידי לחיצה על run במשאבת המזרקים. נמתין להיווצרות טיפת דם בקצה הפלדה שאינה מחלידה.

ברגע שנוצרת טיפה, לחצו על stop, ספגו את הדם העודף, הכניסו אותה למכשיר ולחצו על run. כעת נקבע טיימר לחמש דקות. אוקיי, לאחר זרימה במכשיר במשך חמש דקות, לחצו על stop במזרק החשמלי ושחררו את המזרק.

כעת נחליף את המזרק במזרק של 3 mil המכיל את בופר השטיפה שלנו, שהוא פשוט 1X PBS. שוב, עלינו לוודא שחלקו העליון של המכשיר אטום, ולאחר מכן נסיר את קצה המחט המכיל דם או פלזמה. התחל בהכנה (priming) של המכשיר.

כאשר טיפות נוצרו, נכניס אותן למכשיר ונלחץ על run. נספיג שאריות דם מהצינורית בכניסה או ביציאה, ונניח לזרימה להימשך חמש דקות לאחר שלב השטיפה. שוב, נעצור את משאבת המזרקים ונסיר את המזרק מתושבת המשאבה. לצורך ביצוע צביעת GIM סטנדרטית, תחילה נקבע את התאים ונבצע להם דהידרטציה באמצעות 100% methanol.

כעת, יש לנו מזרק, מזרק של 3 ml הטעון מראש במתנול. שוב, נבצע ה priming למזרק כדי לוודא שהמתנול זורם, נעצור את משאבת המזרקים, נכניס אותו למכשיר ונלחץ על run. נקבע אותם בתמיסת מתנול זו למשך שתיים עד ארבע דקות.

לאחר שתי עד ארבע דקות של קיבוע ומתנול, אנו עוצרים את המשאבה, מרוקנים את המזרק עם המתנול, וכאן נטעין מזרק, מזרק של 3 מיליליטר המכיל תסמיג EEM Sustain סטנדרטי מ-Sigma המדולל ביחס של 1 ל-5 במים דה-יוניים. לאחר הדילול, טענו את התוכן למזרק, ובקצה המזרק חיברנו מסנן של 0.8 מיקרון כדי לסנן חלקיקים שעלולים להגיע למכשיר ולגרום לסתימה. צובעים למשך 5 עד 10 דקות.

לאחר מכן נשטוף עם מים דה-יוניזים. לאחר 5 עד 10 דקות של צביעה, נעצור את משאבת המזרקים ונחליף את המזרק המכיל את תמיסת הצביעה במזרק המכיל מים דה-יוניזים; נשטוף למעשה עד שנראה שהצבע הכחול של ה-SAI נשטף מהמכשיר. ברגע שכל עודפי ה-gim sustain נשטפו מהמכשיר, נעצור את זרימת תמיסת השטיפה.

לאחר מכן, נסיר את מזרק המים מהכניסה. לאחר מכן, ניקח את צינור היציאה של המכשיר ונחזיק את קצה הצינור באמצעות פינצטה.

זהו צינור tigon גמיש ואנו נחזיר אותו אל פתח הכניסה של המכשיר. פעולה זו אוטמת את המכשיר ושומרת על הידרטציה של התאים ועל שלמות המורפולוגיה שלהם. כעת עמיתי, Dr.John Hong Chang, יציג פרוטוקול חלופי לבידוד לימפוציטים CD4 positive, ולאחריו צביעה אימונופלורסצנטית ישירות בתוך המכשיר המיקרופלואידי.

שמי הוא שונג הונג והיום אדגים לכם צביעת תאים במכשיר מיקרופלואידי. בשלב זה כבר הראיתי לכם כיצד להשתמש במכשיר בידוד בעל זיקה אימונית מיקרופלואידית כדי לבודד באופן ספציפי תאי דם מדם מלא שאינו עובד. למטרה זו, הוא מעוניין להמיס את התאים ולהפיק תוכן חלבון ו-DNA מאותם תאים מבודדים. ובכן, למטרות המחקר שלי, אני מעוניין להשיג את התאים ולאחר מכן לקבל את ספירת התאים, למשל, כדי לקבל ספירת תאי CD4 מדם מלא, ולהשתמש בכך כאינדיקטור למטרות אבחוניות.

לכן, המכשיר שבו נעשה שימוש דומה מאוד למכשיר של קן. הוא עשוי מתא PDMS ישר. הגאומטריה שונה מעט, ולכן פרמטרי ההפעלה שונים מעט, בעוד שבשורה הכללית הליך ההפעלה הכולל דומה מאוד.

לפיכך, אני אדלג על כל שלבי לכידת התאים והשטיפה ואעבור ישירות לשלב צביעת התאים בפרוטוקולי ספירת תאים. כאן יש לי מכשיר שבו כבר נלכדו תאים מדם מלא והמכשיר כבר נשטף עם PBS. לפיכך, התאים שאינם רצויים כבר נשטפו החוצה מהמכשיר, והכנתי מראש תערובת נוגדנים המשמשת ספציפית לסמון התאים שבודדו בתוך המכשיר.

ריכוז הנוגדנים שבו השתמשנו כאן עבר אופטימיזציה לצורך צביעת התאים בעוצמה פלואורסצנטית גבוהה מאוד תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הפרוצדורה היא די פשוטה. אנו טוענים למשאבת המזרקים את המזרק הממולא בתמיסת הנוגדנים, ולאחר מכן מוודאים שקצב הזרימה מוגדר לפי הפרמטרים הנדרשים.

לאחר מכן נפעיל את משאבת המזרק, נצפה בקצה הצינור ונוודא שהתמיסה כבר יוצאת כדי שלא יהיו בועות בצינור. לאחר מכן נוכל לחבר את הצינור להתקן המיקרופלואידי שבו נלכדו התאים. כעת הנוגדן זורם אל תוך ההתקן כדי לצבוע את התאים שבידדנו בתוכו; קצב הזרימה שבו אני משתמש כאן הוא 5 µL לדקה, אך בהתאם לגיאומטריה של ההתקן, ייתכנו פרמטרי זרימה שונים שתרצו להשתמש בהם למטרותיכם.

נזרימה של תמיסת הנוגדנים למשך חמש דקות, זמן המספיק כדי להחליף את כל התמיסה בתוך הערוץ המיקרופלואידי. לאחר הזרקת הנוגדנים, נסגור את הזרימה. לפיכך, נזרים נוגדנים בקצב של 5 µL לדקה למשך חמש דקות כדי להחליף את כל התמיסה בתוך המיקרוערוץ.

לאחר מכן אנו עוצרים את הזרימה ומניחים למכשיר להדגיר בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. פעולה זו צריכה להתבצע בחושך כדי שהנוגדנים הפלואורסצנטיים לא יעברו כיבוי (quenching) בזמן שהתאים מדגירים עם נוגדן צביעה. לאחר צביעה הנמשכת בדרך כלל בין 15 ל-30 דקות, ננתק את הצינוריות מהמכשיר ונחליף את מזרק הנוגדנים במזרק בופר כדי לשטוף נוגדנים שאינם קשורים מהמכשיר.

תמיסת השטיפה כאן מכילה 1%BSA בתמיסת PBS. BSA משמש לחסימת קישור לא ספציפי של נוגדנים על פני השטח, ואנו נעשה את אותו הדבר. ראשית, נכוון את קצב הזרימה במזרק החשמלי כדי לוודא שהוא קצב הזרימה הרצוי, ולאחר מכן נפעיל את המזרק החשמלי ונבדוק שנוזל אכן יוצא מהצינור לפני שנחבר אותו למכשיר.

מטרת הפעולה היא למנוע הישארות של בועות אוויר בתוך הצינורית. כך, בעת ההזרקה, לא יחדרו בועות למכשיר. לכן, נחבר את הצינורית למכשיר ונניח לנוזל לזרום במשך חמש דקות נוספות, כדי לשטוף ולהוציא את כל הנוגדנים שאינם קשורים מהמכשיר.

לאחר שלב השטיפה, נקבע את התאים עם 1%PFA. מטרת הפעולה היא לאפשר אחסון של המכשיר למשך מספר שבועות, במידה ולא ניתן לבצע את הדימות באופן מיידי. לפיכך, הפרוצדורה היא פשוטה למדי.

זהו תהליך דומה למה שביצענו בעבר. אנו מעמיסים את המזרק על המשאבה, מכוונים את קצב הזרימה לערך הרצוי, ולאחר מכן מפעילים את משאבת המזרקים ומחברים את הפיתול למכשיר שלנו כדי להזריק את תמיסת ה-paraform IDE, שהיא חומר הקיבוע, אל תוך המכשיר כדי לקבע את התאים. שוב, אנו מאפשרים לתמיסה לזרום במשך כחמש דקות.

לפיכך, ה-PFA מחליף את כל התמיסר במכשיר כדי לקבע את כל התאים במכשיר. לאחר שלב הקיבוע ב-PFA, אנו פשוט מסירים את מזרק ה-PFA וכעת המכשיר מוכן לדימות. במקרים מסוימים, חוקרים מעוניינים לבצע צביעת גרעין כדי להציג אותה כהצמדה לצביעת סמני פני השטח של התאים.

לצורך כך, נבצע בסוף צביעה של הגרעין באמצעות DPI. נטען את מזרק ה-DPI, נפעיל את משאבת המזרקים ונזרים DPI אל תוך המכשיר שלנו. כעת, הגרעינים בתאים הללו ייצבעו כדי להראות את מיקום התאים.

ובאופן זה, ניתן להלביש מאוחר יותר את תמונת הצביעה ב-DPI על הצביעה של סמני השטח כדי להראות היכן נמצאים התאים. לכן, בסיום הצביעה ב-DPI, עלינו לשטוף שוב את ה-DPI שאינו קשור באמצעות תמיסת בופר. שוב, אנו משתמשים ב-PBS המכיל 1% BSA כדי לשטוף את ה-DPI שאינו קשור.

והפעולה דומה לזו שביצענו קודם לכן. אנו פשוט מחברים את מזרק התמיכה (buffer syringe) למכשיר שלנו ונניח לתמיכה לזרום לתוך המכשיר כדי לשטוף את ה-dap שלא נקשר. זהו השלב השלם של צביעת תאים במכשיר מיקרו-פלואידי.

לאחר כל הלימודי הצביעה, המכשירים מוכנים לדימיון. ומכיוון שביצענו קיבוע ב-PFA, ניתן לאחסן את המכשירים למשך מספר שבועות, במקרה שלא ניתן לבצע את הדימיון באופן מיידי.