הסקה Genotypic של כמיהות HIV-1 שימוש אוכלוסייה מבוססת רצף של V3

המטרה הכללית של הליך זה היא להסיק את הטרופיזם הנגיפי בחולה נגוע ב-HIV על ידי ריצוף של אזור ה-V3 בגן המעטפת הנגיפי. ראשית, יש לחלץ H-I-V-R-N-A מפלזמה של דם המטופל. לאחר מכן, יש להגביר את אזור ה-V3 של HIV GP one 20 באמצעות nested R-T-P-C-R. לאחר מכן, יש לזהות את נוכחות התוצר באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל, ולאחריה ריצוף מבוסס אוכלוסייה של תוצרי ה-V3 שהוגברו.

לבסוף, נתחו את הרצפים באמצעות תוכנה לקריאת בסיסים (base calling) והסיקו את השימוש בקו-רצפטור באמצעות אלגוריתם genome to pheno. בסופו של דבר, תוצאות אלו יכולות להראות האם אוכלוסיית הווירוסים של המטופל היא R5 או non-R5, באמצעות ריצוף מבוסס אוכלוסייה של לולאת V3 של HIV. לפיכך, היתרון המרכזי של בדיקת לולאה (troop assay) זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות פנוטיפיות מבוססות תאים, הוא שניתן לבצעה בכל מעבדה המצוידת במכשיר ריצוף, בעלות מופחתת, בזמן קצר יותר ובכמות קטנה יותר של חומר התחלתי.

טכניקה זו רלוונטית לטיפול באמצעות תרפיה אנטי-רטרו-ויראלית מכיוון שהיא יכולה לזהות אם אוכלוסיית הנגיפים של המטופל צפויה להגיב למעכב CCR5 מתוך 500 µL של פלזמה. השתמש במערכת מיצוי אוטומטית EasyMag כדי למצות HIV RNA. כעת, עבור לחדר נקי עבור PCR כדי להכין את ה-RT-PCR, וזאת על מנת להבטיח דגימה נאותה של אוכלוסיית הנגיפים.

תכננו לבצע כל תגובת שכתוב הפוך בשלוש חזרות בתגובה חד-שלבית זו. השתמשו ב-RNA ויראלי להסינתזה של CDNA, תוך הגברה ספציפית של אזור HIVV three באמצעות הפריימרים SQV three F1 ו-CO 6 0 2 prime. התבססו על רכיבי התגובה עבור תגובה בודדת.

הכינו תמיסתו תערובת מלאי (stock mix) בכמות המספיקה למספר הדגימות המיועדות להגברה באמצעות פפית חוזרת (repeater pipette). הוסיפו 36 µL מתערובת הדגימה לכל באר בלוח ה-PCR. כעת עברו להשתמש בפפית רב-ערוצית כדי להעביר מיקרוליטרים של תמצית דגימת RNA לכל אחת מהבאערים הייעודיות. הקפידו להחליף טיפים בין כל הוספה.

עם השלמת ההעברה, כסו את הבארות באמצעות מכסי פסים עבור PCR. לאחר מכן, הניחו את פלטת ה-PCR במכשיר תרמוסייקלר שתוכנת לביצוע R-T-P-C-R שלב אחד עבור אזור HIVV three. עבור ה-nested PCR, השתמשו בפריימרים SQV three F two ו-CD four R.

חשב את כמות הריאגנט הדרושה עבור מספר הדגימות המיועדות להגברה בחדר נקי ל-PCR. הכן את תערובת ה-nested PCR ולאחר מכן השתמש בפפית רב-ערוצית (repeater pipette) כדי לחלק 19 µL לכל באר בלוח PCR נקי. עם סיום ה-R-T-P-C-R, עבור לחדר לאחר הגברה.

השתמשו בפיפט רב-ערוצי בעל שמונה ערוצים כדי להעביר 1 µL של תבנית ה-R-T-P-C-R אל תערובת ה-nested PCR. החליפו קצוות (tips) בין כל הוספה. כסו את הבארות עם מכסי פסים של PCR והעבירו את הפלטה למכשיר תרמוסייקלר (thermocycler) לצורך הגברה.

הוצא את הפלטה מהתרמוסייקלר לאחר שהטמפרטורה חזרה ל-25 °C. כדי לאשר שאזור V3 הועתק בהצלחה, נתח תחילה את התוצרים באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. הכן ג'ל agarose בריכוז 1.6% עם צבע ג'ל cyber safe.

השתמשו בפיפט רב-ערוצי של 10 µL. העבירו דגימות PCR של 8 µL לבארים המתאימות. כמו כן, טענו סולם DNA לפחות לאחת הבארים בכל שורה.

הריצו את הג'ל במתח של כ-100 volts למשך 10 דקות. הדמינו את הפסים באמצעות פלואורסצנציית ultraviolet ותעדו את התמונה באמצעות צילום. רשמו את הדגימות שבהן כל שלוש השכפולים של ההגברה הצליחו.

במידת הצורך, חזרו על ה-R-T-P-C-R עבור אותן דגימות שבהן הושגו פחות משלוש הגברות של המוצר. דגימות ה-CDNA הוויראלי שהוגברו יאומתו בהמשך על ידי תגובות ריצוף DNA שיבוצעו באמצעות הפריימרים V 3 0 2 F ו-S QV three R one. הוציאו את ריאגנט ה-big di מהמקפיא והפשירותו בטמפרטורת החדר.

חשב והכן את הריאגנטים הדרושים עבור מספר הדגימות המיועדות להרצה. חלק חמישה µL של תערובת תגובת הריצוף לבארי הפלטה המתאימים באמצעות פיפט רב-ערוצי. כסה את הפלטה בנייר ניגוב מסוג Kim wipe והסט אותה הצידה.

בינתיים, הכין דילול של 1:15 לתוצר ה-PCR המוגבר על ידי הוספת 180 microliters של מים סטריליים לתוצר ה-PCR שנותר. העבר באמצעות פיפטה מיקרוליטר אחד של הדגימה המדוללת לתחתית הפלטה המתאימה. החלף תמיד טיפים בין דגימות לאחר השלמת העברת הדגימה לבארות.

אטמו את הפלטה באמצעות מכסי פס (strip caps) וערבבו במערבל Vortex למשך שנייה אחת. כדי לסובב את הפלטה בצנטריפוגה, הגדירו את המהירות ל-140 5G. כאשר מהירות הסיבוב תגיע ל-140 5G, עצרו את הסיבוב.

הניחו את הפלטה בטרמוסייקליר (thermocycler) להמשך התגובה. בכל באר, השקיפו את ה-DNA באמצעות 4 µL של sodium acetate בריכוז 3 M ו-40 µL של 95% Ethanol קר, וסגרו חזרה את הפקקים. ערבבו את הפלטה ב-Cortex למשך 10 שניות והקישו על הפלטה כדי להוציא בועות אוויר.

הנח את הפלטות בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שעתיים. השג את ה-DNA באמצעות סנטריפוגציה ב-2000 G למשך 20 דקות. הסר והשליך את מכסי הפס (strip caps).

הפוך את הפלטה מעל מיכל הפסולת ושפוך את הנוזל העליון. הסר שאריות של נוזל עילי על ידי ספיגת הפלטות ההפוכות בנייר סופג.

קפלו שני דפי נייר סופג כדי להקיף את הצלחת. הניחו את הצלחת כשהפנים כלפי מטה בצנטריפוגה וסובבו ב-140 5G. עצרו את הסיבוב כאשר היא מגיעה ל-140 5G.

לאחר מכן, שטפו עם 155 µL של 95% ethanol ושפכו את הנוזל. חזרו על הצנטריפוגה. הניחו לפלטה למשך שתי עד חמש דקות כדי לאפשר לשאריות האתנול להתאדות.

כדי לדנטור את דגימות ה-DNA, השתמשו בפיפטא רב-ערוצית כדי לחלק 10 µL של high dye for maide לכל הבארים בלוחית, כולל אלה שנותרו ריקות. אטמו את הלוחית באמצעות septima והכניסו אותה לתרמוסייקלר בטמפרטורה של 90 °C למשך שתי דקות. לבסוף, הכניסו את לוחית הדגימות לתוך לוחית ריצוף ולאחר מכן למכשיר הריצוף.

דרך מקובלת אחת לניתוח נתונים היא שימוש בתוכנת recall לביצוע קריאה אוטומטית של הבסיסים (base calling) ללא התערבות אנושית. Recall היא תוכנה חופשית לקריאת בסיסים המבוססת על התאמה אישית; התחבר למערכת ובחר את קבצי הדגימות להעלאה באמצעות אפשרית ה-browse. איתור קובץ נתוני הרצף הגולמי והעלאה של עד 20 megabytes.

בשלב הבא, הגדירו את רצף הייחוס ל-V three. לחצו על process data. בחרו בתיקייה שהתקבלה בצד ימין של הדף כדי להציג את רשימת הדגימות.

אלו המופיעים באדום נכשלו. אלו המופיעים בירוק עברו. על ידי לחיצה על דגימה ספציפית ועל כפתור התצוגה, תוכלו לסקור את הרצף, לעקוב אחר ההוראות בצד הימני של הדף כדי לנווט ברצף, ולהוריד קבצים לתיקיית zip.

ניתן להסיק טרופיזם ויראלי מרצפים שהופקו באמצעות ריצוף מבוסס אוכלוסייה תוך שימוש באלגוריתם geno to pheno co-receptor. מהתפריט הנפתח של ההגדרה המשמעותית (significant setting), בחר באפשרות המותאמת (optimized) על בסיס ניתוח נתונים קליניים מ-motivate 2% ו-5.75% FPR. כעת בחר להעלות או להדביק רצף לצורך ניתוח.

קבצי FASTA מקובלים. אין להוסיף קבצים אחרים; המשיכו כדי להוציא תחזית geno Tono FPRA לתגובה למעכבי CCR5. הדוח G two P שנוצר מספק את רצף הלולאה V3 בחומצות אמינו ומציין מיקומים רלוונטיים של מוטציות הקשורות לנגיף שאינו מקשר ל-R5.

בתחתית הדוח מופיע שיעור הפוזיטיביים הכוזבים, המפורש במונחים של תגובה למעכב CCR5. ניתן להוריד דוח זה כקובץ PDF. אם אחת משלוש הרצפים מדגימה מסויימת מזוהה כלא R5, הסבירות היא שהמטופל לא יגיב למעכב CCR5 כצפוי. אלקטרופורזה של ג'ל של הגבריקציות של RTP CR של לולאת V3 של HIV-1 מעידה שלא כל הדגימות הקליניות מפיקות תוצר.

ניתן להציג את הרצפים שהופקו מהדגימות המוגברות בכרומטוגרמה שנקראה באמצעות recall. צפויה קבלת רצף נקי עם מעט תערובות. לעיתים הרצפים עשויים להיות לא ברורים ולא כשירים להשמה מדויקת של הבסיסים.

ניתן לזהות חלק מהחולים כבעלי נגיף שאינו משתמש ב-CCR5, כפי שמוצג כאן. מטופלים אלו אינם צפויים להגיב לטיפול באמצעות אנטגוניסט ל-CCR5. עם זאת, ברוב המקרים נמצא כי אוכלוסיית הנגיפים מורכבת מנגיפים המשתמשים ב-CCR5, כפי שמעידה תיבה ירוקה בתחתית דוח ניתוח ה-G two P.

ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצע אותה בערך במשך ארבעה ימים מהתחלה ועד לסוף. המשך הוא מהשלב של המיצוי ועד לשלב הניתוח. לאחר צפייה בסרטון זה, צריכה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לחזות טרופיזם ויראלי באמצעות שיטות ריצוף מבוססות אוכלוסייה בשילוב עם האלגוריתם הביואינפורמטי genome pheno.

זהו כל השלב. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.