הגבלת אנזים מבוסס שיבוט שיטה להערכה

המטרה הכללית של הליך זה היא להטמיע גנים של gag המופקים מאנשים נגועים ב-HIV1 מסוג C לתוך פלסמיד HIV1 בעל יכולת שכפול, וזאת כדי להעריך את ההשפעה של פולימורפיזמים ברצף ה-gag על יכולת השכפול של HIV1 in vitro. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הגברה של גן ה-gag מפלזמה של החולה. השלב השני הוא שיבוט של רצף ה-gag המופק מהחולה לתוך השבט המולקולרי המדבק ובעל יכולת השכפול MJ-four. לאחר מכן, פלסמיד הכימרה gag-MJ-four עובר טרנספקציה כדי לייצר מאגרי נגיף מדבקים, ואלו נמדדים (titered) כדי להעריך את המדבקות שלהם על קו תאים אינדיקטורי. השלב הסופי הוא מדידת יכולת השכפול in vitro בקו תאי T מסוג GXR-25. לבסוף, נעשה שימוש במבחן reverse transcriptase מסומן רדיואקטיבית כדי לכמת את ייצור הוויריונים לאורך זמן, במטרה להמחיש את קינטיקת השכפול הנגיפי.

השיטה שנתאר היום יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום ה-HIV. אלו כוללות הגדרת הגורמים המשפיעים על הכשירות השכפולית (replicative fitness) של HIV והבנה כיצד כשירות זו משפיעה על הפתוגנזה לטווח ארוך. את השיטות יתארו היום ג'סיקה פרינס ודן קלייבורן, שניים מהסטודנטים שלי לתארים מתקדמים.

כדי להתחיל בהליך זה, בצעו שעתוק חוזר של cDNA מ-RNA והגבירו את תוצרי ה-DNA מהסבב הראשון באמצעות reverse transcriptase ו-DNA polymerase תרמו-יציב ב-RT-PCR שלב אחד. לאחר מכן, השתמשו במיקרוליטר אחד של הגברת ה-PCR מהסבב הראשון כתבנית DNA, ובצעו הגברת PCR שנייה בשיטת nested PCR. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של 5X loading dye לחמישה מיקרוליטרים מנפח התגובה של הסבב השני.

הריצו את הדגימות במתח של 120 volts על ג'ל agarose TAE בריכוז 1% המכיל צבע DNA פלואורסצנטי למסך UV עד להפרדת הפסים. לאחר מכן, הדגמיו את הפסים בגודל 1.6 KB באמצעות מאיר אור כחול. לאחר מכן, הריצו את שאר נפח התגובה, 45 microliter, על ג'ל agarose TAE בריכוז 1% המכיל את צבע ה-DNA. חתכו את הפסים המתאימים בעזרת להב תער נקי ושמרו שלוש תגובות חיוביות עבור כל פרט. לאחר מכן, חלצו את ה-DNA מפרוסת הג'ל באמצעות ערכת טיהור ג'ל והבמיסו אותו במים נקיים מנוקליאז (nuclease free water). הקפיאו את התוצר בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius לשימוש מאוחר יותר. 0:15:56 בהליך זה, לאחר הגברה של אזור ה-five prime UTR של ה-long terminal repeat בפלסמיד MJ-four, הדגמיו את תוצרי ה-PCR בגודל 1.3 KB על המאיר. חתכו את האמפליקונים החיוביים, ולאחר מכן טהרו והקפיאו אותם כפי שמתואר לעיל. כעת, צרו את אמפליקוני ה-fused MJ-four LTR gag באמצעות splice overlap extension PCR. הדגמיו, חתכו, טהרו והקפיאו את האמפליקון הארוך בגודל 3.2 kb. כעת, בצעו עיכול של 1.5 micrograms של פלסמיד MJ-four ו-1.5 micrograms של תוצר PCR מטוהר של LTR-gag באמצעות האנזימ המגביל BCL-one למשך 1.5 hours בטמפרטורה של 50 degrees Celsius. לאחר מכן, הוסיפו one microliter של NGOM-four לתגובת העיכול והדגירו אותה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסיפו 5x loading dye לתגובות העיכול האנזימטי. בצעו אלקטרופורזה באיטיות לנפח הכולל על ג'ל agarose TAE בריכוז 1% המכיל צבע DNA, למשך שעה עד שעתיים במתח של 100 volts. הדגמיו, חתכו וטהרו את הפסים המצוינים לצורך שיクלונו כפי שמתואר לעיל.

בשלב הבא, הכינו את תגובות הליגציה באמצעות מקטע LTR-gag מנוקה ו-DNA של וקטור MJ-four, ביחס של שלושה לواحد בין המקטע לווקטור. דגרו את תגובות הליגציה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C.

לאחר מכן, בצע טרנספורמציה לחיידקי JM-109 בעלי כשירות כימית עם תוצרי הליגציה על מצעי LB agar עם 100 micrograms per milliliter Ampicillin. גדל את החיידקים שעברו טרנספורמציה ב-30 degrees Celsius למשך 22 שעות לפחות. כדי לאשר את דיוק השכפול, בצע עיכול כפול ל-DNA מה-mini prep באמצעות אנזימי ההגבלה NGOM-four ו-HPA-one ב-37 degrees Celsius למשך שעתיים.

לאחר מכן, נתחו זאת על ג'ל agarose TAE בריכוז 1%. חשבו את נפח הנגיף הדרוש מכל מאון על בסיס הטרטר (titer) של IU למיקרוליטר ממבחן תאי TZM-BL, כדי להדביק 5×10⁵ תאי GXR-25 בריבוי הדבקה (MOI) של 0.05. הקפידו ללבוש ציוד מגן אישי מתאים לעבודה עם HIV בעל יכולת שכפול, הכולל חלוק לבש מלא, מסכת פנים וכפפויות כפולות. ביום ההדבקה, הוציאו את מאוני הנגיף מהמקפיא בטמפרטורה של 80°C- והמיסו. לאחר מכן, דללו את הנגיף במצע C-R-P-M-I לנפח של 100 µL, כדי להגיע ל-0.05 MOI. הוסיפו זאת לפלטת 96 בארות בעלת תחתית בצורת V שעובדה לתרבית רקמה, כולל ביקורת חיובית ושלילית בכל סדרת ניסויי שכפול, וסדרו את הפלטה כך שכל עמודה שנייה תישאר ריקה כדי להגביל זיהום צולב בין הבארות. לאחר מכן, ספרו את תאי GXR-25 באמצעות סופר תאים אוטומטי וחשבו את מספר התאים הדרוש בסך הכל לכל ההדבקות. העבירו את הנפח הנדרש לשפופרה קונית של 50 mL וסבבו בצנטריפוגה כדי לשקע את התאים. לאחר מכן, שאבו את המצע בזהירות ושספנדו ב-C-R-P-M-I בריכוז של 5×10⁵ תאים ל-100 µL. העבירו את התאים בעזרת פיפטה לאגן סטרילי וערבבו היטב. לאחר מכן, בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 100 µL של תאים לכל בארה בפלטת 96 הבארות המכילה את הנגיף המדולל וערבבו היטב. לאחר מכן, הוסיפו לכל בארה 2 µL של תמיסת polybrene בריכוז 5 mg/mL וערבבו את התאים היטב. לאחר מכן, הדגרימו בטמפרטורה של 37°C באינקובטור לתרבית רקמה עם 5% CO2 למשך שלוש שעות.

כדי לשטוף את התאים המודבקים, סבב במרכזפוגה את פלטת 96 הבארים בעלת התחתית ה-V כדי לשקיע את התאים. לאחר מכן, הסר בזהירות 150 µL מהמדיום והחלף ב-150 µL טריים של C-R-P-M-I מבלי להפריע למשקע התאים. חזור על הפעולה פעמיים נוספות כדי לשטוף את התאים באופן מספיק. לאחר הסבב האחרון במרכזפוגה והוספת 150 µL של C-R-P-M-I, השהה מחדש את משקע התאים באמצעות פיפטה רב-ערוצית. העבר את התערובת מכל באר ל-800 µL של C-R-P-M-I בבאר של פלטת תרבית רקמות בעלת 24 בארים. לאחר מכן, הנח את הפלטה באינקובטור לתרבית רקמות ב-5% CO2 ובטמפרטורה של 37 °C. מדי יומיים, העבר 100 µL מהעל-נוזל (supernatant) מפני השטח של באר התרבית לבאר בפלטת 96 בארים בעלת תחתית U והקפא לאנליזה עתידית באמצעות בדיקת RT. לאחר מכן, השהה את התאים ביסודיות והסר חצי מהנפח שנותר כדי למנוע צמיחת יתר של התאים. לאחר מכן, השב את הנפח המקורי על ידי הוספת 550 µL של C-R-P-M-I טרי לכל באר.

בנוהל זה, הוסיפו מיקרוליטר אחד עד שניים של 10 millicuries per milliliter של DTTP וארבעה מיקרוליטרים של DTT בריכוז one molar לכל אליקוט של 1 milliliter של תערובת RT master mix. ערבבו בזהירות כל מבחנה של 1.5 milliliter למיקרו-צנטריפוגה המכילה RT master mix, DTT ו-DTTP באמצעות פיפט של 1000 microliter והעבירו למשבץ סטרילי.

בשלב הבא, העבירו 25 µL של תערובת RT מסומנת לכל באער בלוח PCR בעל דפנות דקות של 96 באערים. הוסיפו 5 µL מכל עלית ללוח ה-PCR המכיל את תערובת ה-RT המאסטר. לאחר מכן, אטמו את לוח ה-PCR באמצעות כיסוי רדיד דביק והדגירו למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 °C בטרמוסייקלר. לאחר ההדגרה, צרו חורים קטנים בכיסוי הרדיד באמצעות פיפט רב-ערוצי של 200 µL. ערבבו את הדגימות חמש פעמים. העבירו 5 µL מכל דגימה לנייר DE-81 והניחו לכל הדגימות להתייבש באוויר במשך 10 דקות. הניחו את הבלוטים במיכלים נפרדים לשטיפה. לאחר מכן, שטפו את הבלוטים חמש פעמים עם 1X SSC. לאחר מכן, שטפו פעמיים עם 90% ethanol למשך חמש דקות לכל שטיפה לפני ייבושם באוויר. לאחר הייבוש, עטפו בזהירות את הבלוט בנייר נצמד וחשפו אותו למסך זרחני (phosphoscreen) בתוך קסטה אטומה היטב למשך לילה בטמפרטורת החדר.

במידה והן מוכנות, נתחו את מסכי הפוספור (phosphoscreens) באמצעות מדמרי פוספור (phosphor-imager) וכמתו את התמלילים הרדיואקטיביים.

מוצג. להלן תמונות ג'ל מייצגות המתארות את ההפרדה האלקטרופורטית של מכפלי ה-PCR השונים הדרושים ליצירת מכפל gag מהחולה, המסוגל לעבור שיבוט אל תוך השלד של פלסמיד MJ-four. תמונת ג'ל מייצגת זו מתארת את ההפרדה האלקטרופורטית של עיכולי רסטריקציה עבור שיבוט של גני gag מהחולה אל תוך MJ four.

תמונת הג'ל המייצגת זו מציגה הפרדה אלקטרופורטית של עיכולים עם אנזימי הגבלה של DNA פלסמיד כימרי purified gag MJ-four. גרף זה מראה את הדירות של בדיקת השכפול לאורך זמן בקו התאים GXR-25. אותם וירוסים כימריים gag MJ four שימשו להדבקת תאי GXR-25 בשני ניסויים עצמאיים שנערכו בהפרש של כשנה אחת.

ציוני השכפול הופקו על ידי חישוב השיפוע של ערכי DLU שעברו טרנספורמציה לוגריתמית ונרמול של שיפוע זה לסוג הברי (wild type) MJ-four. שתי המדידות העצמאיות נמצאות במתאם חזק ומדגישות את השחזוריות של הבדיקות שבוצעו בזמנים שונים ועם תאים במעברים שונים. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום ה-HIV AIDS לחקור את הדטרמיננטים הויראליים של הפתוגנזה, בזיהום חריף מסוג subtype C, הסוג הנפוץ ביותר ברחבי העולם. עבודה עם HIV בעל יכולת שכפול עלולה להיות מסוכנת ביותר. יש לבצע את כל השלבים הכוללים וירוס חי במתקן ברמת בטיחות BSL two plus. יש לחטא את כל המשטחים באופן קבוע ולהשתמש בכפפות כפולות בכל עת.