חרוזים ועל הפרדת תאים ריבוי ערוצים מכשירים microfluidic שימוש dielectrophoresis ו זרימה למינרית
4 בפברואר 2011
Dielectrophoresis (DEP) היא שיטה יעילה לתפעל תאים. מעגלים מודפסים (PCB) יכול לספק אלקטרודות זול, לשימוש חוזר ויעיל מניפולציה מגע חופשי בתוך התא מכשירים microfluidic. על ידי שילוב של PDMS מבוססי ערוצי microfluidic עם coverslips על PCBs, אנחנו מדגימים מניפולציה חרוז תא הפרדה בתוך מכשירים microfluidic רב.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבצע מניפולציה של תאים וחרוצים בתוך התקני מיקרופלואידיקה באמצעות דיאלקטרופורזה (DEP) תוך שימוש בלוחות מעגלים מודפסים (PCBs). דבר זה מושג תחילה על ידי תכנון והכנה של אלקטרודות ה-PCB ותעלות המיקרופלואידיקה. השלב השני של ההליך הוא הכנת מכלול המיקרופלואידיקה של ה-PCB ותמיסות התאים והחרוצים.
השלב השלישי של הפרוצדורה הוא מילוי התעלות במדיום בעל מוליכות נמוכה, ולאחר מכן טעינת החרו지를 והתאים. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא חיבור מכלול ה-PCB למגבר ההספק ולמחולל הפונקציות, ולאחר מכן הפעלת ה-DEP. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המדגימות הפרדה ומניפולציה של תאים וחרוזים בהתקנים מיקרופלואידיים באמצעות שימוש ב-DEP.
באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בתחילה, כיוון שעל המשתמש להבין את עקרונות ה-DEP כדי לפתח אלקטרודה יעילה הפועלת עם התקן מיקרופלואידי למניפולציה של התאים או החרוצים הרצויים. מאידך, שימוש ב-PCBs כאלקטרודות הופך את הפעלת התאים והחרוצים בהתקנים מיקרופלואידיים לנגישה עבור מגוון תחומים מדעיים. השלב הראשון של פרוצדורה זו הוא תכנון לוח המעגלים המודפס או אלקטרודות ה-PCB כך שיהיה להן את הגאומטריה הרצויה ליצירת שדה חשמלי שאינו אחיד.
כאשר התכנון יושלם, הזמינו את שבבי אלקטרודות ה-PCB המותאמים אישית דרך מתקן ייצור מסחרי. לאחר הגעת ה-PCB שהוזמן במיוחד, פתחו אותו ובחנו אותו לצורך הדגמה זו. ה-PCB הוא באורך 8.4 centimeters וברוחב 2.1 centimeters.
אלקטרודות המתכת הן ברוחב של five millimeters. בדוגמה זו, לאלקטרודות יש שני פסים ארוכים של מתכת ושני אזורי חיתוך באורך של 4.5 millimeter שבהם האלקטרודות מסודרות במבנה של אצבעות משולבות (interdigitated). אזורים אלו יוצרים שדה חשמלי חזק שאינו אחיד כדי ליצור חיבור מהמעורר (stimulator) לאלקטרודת ה-PCB.
מקם חוט בבב gauge 16 על קצה האלקטרודה. השתמש במלחם חם כדי לקבע את החוט למשטח המתכת של ה-PCB. פעולה זו מחממת את החוט.
הצמידו את הבדיל לחוט החם ואפשרו לכמות קטנה של בדיל לזרום לתוך החוט. לאחר שהחוט התמלא בבדיל, הסירו את מלחם הבדיל תוך כדי החזקת החוט במקומו בזמן שהבדיל מתקרר. חזרו על תהליך ההלחמה עבור החיבור החשמלי השני ב-PCB.
השלב הבא הוא להכין תעלות מיקרופלואידיות עם תבנית ההסתעפות הרצויה. באמצעות טכניקות מיקרו-פבריקציה סטנדרטיות, צור תבנית מאסטר להגדרת התעלות באמצעות פרוסת סיליקון ופוטורזיסט SU-8. לתבנית מאסטר זו יש תעלת כניסה אחת ושלוש תעלות יעד.
רוחב התעלות הוא 100 micrometers, וגובה התעלות הוא 27 micrometers. לאחר יצירת תבנית המאסטר, מערבבים את אלסטומר ה-polymethyl LAANE או ה-PDMS עם חומר מעמיד ביחס משקלי של 10 ל-1 למשך חמש דקות. שופכים את ה-PDMS הנוזלי על תבנית המאסטר המכינה מ-SU eight ומסירים בועות אוויר על ידי חשיפת ה-PDMS הנוזלי לוואקום למשך שלוש דקות.
חזור על תהליך הוואקום במידת הצורך כדי להסיר לחלוטין את כל הבועות. ניתן להשתמש בזרם של גז חנקן להסרת בועות עודפות במידת הצורך. בשל את ה-PDMS בתנור בטמפרטורה של 70 °C למשך שעתיים.
השתמשו בלהב תער כדי להסיר את שכבת ה-P-D-M-S-S עם התעלות המיקרופלואידיות מהפרוסה (wafer), תוך הקפדה לא לשבור את הפרוסה כאשר חלל התעלות פונה כלפי מעלה. השתמשו במנקב ביופסיה כדי ליצור חורים להחדרת נוזלים ותאים אל תוך ההתקן המיקרופלואידי. קצצו את השוליים.
שאריות PDMS עודפות. בדקו את ההתקן המיקרופלואידי כדי לוודא שהוא נקי מאבק ומלכלוך. השתמשו בסרט הדבקה מסוג 3M Scotch Magic כדי לנקות את ה-PDMS.
חשפו את ערוצי ה-PDMS ואת כיסוי זכוכית (cover slip) נקי מספר אפס בעובי 80 עד 130 µm לגז פלזמה למשך 1.5 דקות. הוציאו את ה-PDMS ואת כיסוי הזכוכית ממנקה הפלזמה אל תוך צלחת פטרי; הצמידו באמצעות פלזמה את ערוצי המיקרופלואידיקה של ה-PDMS כך שיהיו מונחים על כיסוי הזכוכית. חממו את מכלול המיקרופלואידיקה הכולל את כיסוי הזכוכית על פלטה חמה המכוונת ל-100 °C למשך 15 דקות לפחות. השלב האחרון בהכנת התקן המיקרופלואידיקה הוא מיקום ערוצי ה-PDMS וכיסוי הזכוכית מעל האלקטרודות של ה-PCB.
התחילו בהנחת כ-10 µL של שמן מינרלי על ה-PCB. כדי להבטיח מגע הדוק בין ה-PCB לבין זכוכית הכיסוי, הניחו את מכלול ערוץ המיקרופלואידיקה של זכוכית הכיסוי על ה-PCB המשומן יחד עם זכוכית הכיסוי. בעת המגע עם השמן, לחצו בעדינות על מכלול המיקרופלואידיקה של זכוכית הכיסוי כלפי מטה כדי להבטיח מגע טוב ולמזער בועות אוויר שעלולות לפגוע בויזואליזציה של התאים והחרוצים.
שלב חשוב נוסף הוא הכנת תערובת המדיה בעלת המוליכות הנמוכה, המכילה 8.5% sucrose ו-0.3% glucose (משקל לנפח) במים דה-יוניים. ההתקן המיקרופלואידי מוכן כעת לשימוש; באמצעות פיפט, מלאו כל תעלה מיקרופלואידית ב-15 עד 20 µL של המדיה בעלת המוליכות הנמוכה, במידת הצורך. השתמשו בשאיבת ואקום כדי להסיר בועות מהתעלות.
השלב הבא הוא הכנסת חלקיקי הבדיקה אל תוך ההתקן המיקרופלואידי. הדגמה זו משתמשת בתליה של 550 חרוזי פוליסטירן למיקרוליטר של מצע בעל מוליכות נמוכה; כיוון שהחרוזים עלולים לשקוע עם הזמן, יש לתלותם מחדש באמצעות ערבוב. לאחר מכן, באמצעות פיפטה, הכניסו 200 microliters של תליית חרוזי הפוליסטירן אל תוך התעלה.
השלב הבא הוא להכין את האלקטרודות, ולחבר את המוצא של גנרטור פונקציות לכניסה של מגבר הספק AC. לאחר מכן, חברו את מוצא המגבר לחוטי האלקטרודות. כסו את כל החוטים החשמליים ואת משטחי המערך בסרט בידוד כדי להגן על המשתמשים מפני חשיפה אפשרית להתחשמלות.
הגדירו את מחולל הפונקציות להפקת גל סינוס בתדר של 1 עד 1.5 megahertz. הפעילו את ה-DEP כדי להתחיל במיון התאים והחרוזים במערך זה. תעלת הכניסה נמצאת מימין ושלוש תעלות היעד נפרדות בצומת התשלוח.
אלקטרודות ה-PCB תואמות לפסים השחורים ללא זרימה למינרית וללא DEP. החרוצים נותרים למעשה סטטיים עם הפעלת ה-DEP, אך ללא זרימה. החרוצים נעים לעבר אלקטרודות ה-PCB והתרחקו מהמרווח שבין האלקטרודות כאשר הזרימה הלמינרית פועלת.
אך כאשר ה-DEP כבוי, החרו지를 הזורמים דרך תעלות הכניסה מתחלקים בין שלושת תעלות היעד. כאשר ה-DEP מופעל והזרימה הלמינרית פעילה, החרו지를 מופעלים כך שיזרמו רק בתעלה המרכזית. בסרטונים הבאים, ההתקן המיקרופלואידי סובב מעל אלקטרודות ה-PCB, מה שהביא לשינוי בכיוון של התעלות.
ביחס לאלקטרודות ה-PCB. תעלת הכניסה, שהייתה קודם לכן ניצבת לאלקטרודות ה-PCB, היא כעת כמעט מקבילה לאלקטרודות כאשר הזרימה הלמינרית פעילה. אך כאשר ה-DEP כבוי, החרוזים נכנסים לשלוש תעלות המטרה באופן שווה.
עם הפעלת ה-DEP, החרו지를 מתקרבים לנקודת הפיצול התלת-כיוונית וכוח ה-DEP מושך את החרו지를 אל התעלה הצדדית שמעל האלקטרודה. סדרת הדמויות הבאה בסרטון מציגה תערובת של תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי או תאי HT 29 וחרו지를 פלואורסצנטיים בתוך ההתקן המיקרופלואידי. בתמונת DIC זו, החץ הפתוח מציין את כיוון הזרימה הלמינרית, והתעלות מסומנות בקווי מקווקו.
ניתן לראות את אלקטרודות המתכת המחזירות כפס רקע בהיר, ונעשה שימוש במיקרוסקופיית DIC כדי לדמות את החרוצים בזמן הזרח. עצימות קנה מידה. התמונות משמשות להפיכת התאים לנראים יותר.
איור זה הוא אותה תמונה כמו האיור השני, אך מוצגת כתמונת עוצמה בסולם זוהר (glow scale), כדי להמחיש את התאים ואת החרוזים כאחד. האלקטרודות המתכתיות המחזירות אור נראות באיור זה כפסים בצבע צהוב וירוק. באמצעות DEP, החרוזים יוצאים מהערוץ הימני כפי שמוצג בתמונת ה-DIC, בעוד שתאי HT 29 יוצאים מהערוץ המרכזי והשמאלי כפי שמוצג בתמונת סולם הזוהר לפני הפעלת ה-DEP. תמיסה מעורבת של תאים וחרוזים זורמת מערוץ כניסה אחד לשלושת ערוצי היעד הנפרדים.
לאחר השראת DEP, החרוזיים והתאים מופעלים באופן סלקטיבי אל תוך תעלות נפרדות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו מתחילים ליישם דיאלקטרופורזה למניפולציה של תאים וחרוזיים בתוך התקני מיקרופלואידיקה.
סקירה כללית
מאמר זה דן בשימוש בדיאלקטרופורזה (DEP) למניפולציה של תאים וחרוצים בתוך התקני מיקרופלואידיקה באמצעות לוחות מעגלים מודפסים (PCBs). באמצעות שילוב של ערוצי מיקרופלואידיקה מבוססי PDMS עם PCBs, מודגמות מניפולציה והפרדה יעילות של חלקיקים ללא מגע.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרופלואידיקה
- מניפולציה של תאים
- דיאלקטרופורזה
רקע
- דיאלקטרופורזה (Dielectrophoresis) היא שיטה למניפולציה של חלקיקים באמצעות שדות חשמליים לא אחידים.
- מעגלים מודפסים (Printed circuit boards) מציעים פתרון חסכוני ליצירת אלקטרודות.
- התקנים מיקרופלואידיים חיוניים לשליטה מדויקת בזרימת נוזלים ובמניפולציה של חלקיקים.
- הבנת עקרונות ה-DEP חיונית ליישום יעיל במיקרופלואידקה.
מטרת המחקר
- להדגים את ההיתכנות של שימוש ב-PCBs עבור DEP ביישומים מיקרופלואידיים.
- לספק פרוטוקול שלב-אחרי-שלב להקמה של מערכות DEP.
- להציג מניפולציה והפרדה של תאים וחרוזיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון וייצור של אלקטרודות PCB עם גיאומטריות ספציפיות.
- הכנת תעלות מיקרופלואידיות באמצעות PDMS ופוטורזיסט SU-8.
- מילוי התעלות במדיום בעל מוליכות נמוכה והחדרת חלקיקי בדיקה.
- חיבור ה-PCB למגבר הספק ולגנרטור פונקציות להפעלת DEP.
תוצאות עיקריות
- מניפולציה מוצלחת של חרוזיים ותאים בתוך המכשיר המיקרופלואידי.
- הדגמה של הפרדה יעילה באמצעות DEP.
- ביסוס של שיטה אמינה לשימוש ב-PCBs ביישומים מיקרופלואידיים.
- אישור ויזואלי של התנהגות החלקיקים בתנאי DEP.
מסקנות
- מעגלים מודפסים (PCBs) מספקים גישה מעשית ל-DEP במיקרופלואידיקה.
- המחקר משפר את הנגישות לטכניקות DEP על פני דיסציפלינות מדעיות שונות.
- הבנת עקרונות ה-DEP חיונית לאופטימיזציה של תכנון האלקטרודות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דיאלקטרופורזה (DEP) המשתמשת באלקטרודות של לוחות מעגלים מודפסים (PCB) מאפשרת מניפולציה והפרדה ללא מגע של תאים וחרוזיים במערכות מיקרופלואידיות, ומציעה חלופה חסכונית לציוד ייעודי כגון פינצטות אופטיות. גישה זו תומכת בתיקוף של מטרות בשלבים מוקדמים ובפיתוח בדיקות על ידי אספקת בקרה מדויקת על מיקום החלקיקים בזרימה למינרית, ובכך מפחיתה את ההסתמכות על תהליכי ייצור מורכבים. השיטה מגבירה את הביטחון בחיזוי במסלולי זרימה של גילוי, על ידי כך שהיא מאפשרת הפרדה כמותית וניתנת לשחזור של חלקיקים ביולוגיים וסינתטיים לצורך ניתוחים המשכיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של תגובות תאיות לכוחות דיאלקטרופורזיים, ובכך תומך בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות מניפולציה מבוקרת של חלקיקים.
- ערך תפעולי: משתמש באלקטרודות PCB נגישות כדי להוריד את חסמי ההטמעה של DEP במעבדות גילוי רב-תחומיות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מקל על הכנת תרחיפי חרוזיים ותאים סטנדרטיים במצעים בעלי מוליכות נמוכה עבור בדיקות מיקרופלואידיות הניתנות לשחזור.
- ערך תפעולי: מאפשר הפרדה ניתנת להרחבה (scalable) של חלקיקי בדיקה לתעלות מוגדרות, ובכך תומך במוכנות לסריקה בשקיפות גבוהה (high-throughput screening).
מחקר תרגומי וקליני-קדם
- ערך מדעי: מדגים הפרדה של תאי אדנוקרצינומה של המעי הגס מסוג HT29 מחריזות, ובכך מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: תומך ברציפות משלב הגילוי לזרימות עבודה פרה-קליניות על ידי אפשור מיון תאים ללא סימון (label-free) המבוסס על תכונות דיאלקטריות.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי על ידי מתן אפשרות לבדיקת היפותזות בשלב מוקדם באמצעות מניפולציה מבוקרת של חלקיקים, התקדמות לפיתוח בדיקות (assays) באמצעות הפרדה הדירה, ותמיכה במחקר תרגומי באמצעות בידוד תאים הרלוונטיים למחלה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים ביולוגיים על ידי התרה של מיקום מדויק של תאים וחרוזים בערוצים מיקרופלואידיים תחת DEP.
- סריקה: מספקת מוכנות לבדיקה באמצעות הפרדה סטנדרטית של חלקיקים לערוצי מטרה, מה שמבטיח קריאות עקביות להערכת תרכובות.
- אנליזה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים באמצעות איסוף חלקיקים ספציפיים לערוץ, מה שמאפשר השוואה סטטיסטית בין תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית על ידי בידוד תאים הרלוונטיים למחלה (למשל, HT29) מאוכלוסיות מעורבבות לצורך תיקוף נוסף.
- שימוש חוזר ארגוני: מציב את ה-DEP מבוסס ה-PCB כפלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר בפרויקטים שונים, הודות לעיצוב אלקטרודות סטנדרטי ולהרכבה מיקרופלואידית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי בתיקוף מטרה באמצעות הפרדה דיאלקטרופורטית של תאים וחרוזים על בסיס תכונות אינהרנטיות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה והדירות באמצעות גיאומטריית אלקטרודות של PCB ופרוטוקולים של מצעים בעלי מוליכות נמוכה.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות של go/no-go על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במחקרי התנהגות חלקיקים בשלבים מוקדמים.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון באמצעות נתוני הפרדה מהימנים המנחים את קידומה של מערכי בדיקה מבוססי תאים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בעקרונות דיאלקטרופורזה ובתכנון אלקטרודות ליצירת שדות שאינם אחידים ביעילות.
- תלוי בגישה למתקני ייצור של מעגלי PCB ולציוד ליציקת מיקרופלואידיקה מ-PDMS.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לגבי מימדי התעלות, מוליכות המצע והגדרות תדר.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה לסוגי תאים או לגדלי חלקיקים שונים.
- מוגבל בשל הצורך בניקוי גזים בוואקום ובקישור פלזמה להבטחת שלמות המכשיר וצמצום היווצרות בועות.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:05
Title
0:58
Introduction
1:27
Prepare the PCB Electrodes
2:46
Prepare the Microfluidic Channels
5:04
Assemble the Microfluidic Channels onto the PCB Electrodes
5:53
Sort and Concentrate Beads and Cells Using DEP
7:07
Separate Beads and Cells Using DEP Actuation
9:25
Conclusion
