מכשיר microfluidic ללימוד זני Distinct מרובים
9 בנובמבר 2012
אנו מציגים שיטה פשוטה לייצר מכשירים המסוגלים החלת תנאים דינמיים דומים לזנים שונים מרובים microfluidic, ללא צורך בחדר נקי או ליתוגרפיה הרכה.
המטרה הכוללת של השיטה הבאה היא לדמות את התנהגותם של תאים בודדים מזנים שונים של שמרים תחת אותם תנאים דינמיים. דבר זה מושג על ידי ייצור של התקן מיקרופלואידי דו-שכבתי, כאשר השכבה התחתונה תכיל כל אחד מהזנים השונים בנפרד, והשכבה העליונה תספק את תנאי הזרימה הדינמיים כשלב שני. זני שמרים שונים מונחים בבארות וההתקן נסגר, מה שיוצר תעלה אחת עם מספר זנים מופרדים.
בשלב הבא, נדמיין את תגובות התאים לשינויים דינמיים במצע. באמצעות בקרת קצבי הזרימה בשתי הכניסות של תעל T, התוצאות מראות זנים שונים החשופים לאותם תנאים דינמיים, ללא זיהום צולב בין הבארות. למכשיר מיקרופלואידי זה מספר יתרונות מרכזיים על פני מערכות קיימות אחרות. הוא מאפשר דימוי של מספר זנים נבדלים תחת אותם תנאים דינמיים.
בנוסף, באופן חשוב, ניתן לייצר אותו בקלות בכל מעבדה ללא צורך בציוד מיוחד. שיטה זו נוצרה מתוך דיון על אופן מעקב אחר תגובותיהם של בידודים שונים של שמרים פראיים מהמזרח למעברי הרעבה. ראשית, שרטטו או הדפיסו במقياس המתאים את פריסת המיקרו-ערוצים הרצויה.
בשלב הבא, כסו תבנית זכוכית בשכבות של סרט הדבקה (scotch tape). כדי להשיג את הגובה הרצוי של התעלה, הניחו את תכנון הפריסה על משטח שטוח ויישרו את התבנית מעל דגם הפריסה. כעת, חתכו בזהירות את הסרט על תבנית הזכוכית בהתאם לפריסה. הסירו את סרט ההדבקה מכל אזורי תבנית הזכוכית.
קבלו אותם בפריסה של המיקרו-ערוץ. הניחו את הזרימה בתנור חימום בטמפרטורה של 65 °C למשך שלוש דקות. לאחר מכן, נקו בעדינות באמצעות אתנול.
ערבבו את רכיבי הבסיס והמעבדה (curing components) של ה-PDMS לפי המלצות היצרן. שפכו כ-30 milliliters של תערובת ה-PDMS לתוך צלחת פטרי לגובה של כ-0.5 centimeters. במידת הצורך, בצעו ניקוי גזים (degassing) של ה-PDMS בוואקום.
טבלו את פלטת הזכוכית בתוך ה-PDMS כאשר סרט ההדבקה המדוגם פונה כלפי מעלה. הנחת הדגם לאחר ה-PDMS מונעת היווצרות בועות אוויר בין הפלטה לתחתית הכלי. השקיעו שלוש מיליליטר של תערובת PDMS בתוך צלחת פטרי חדשה בקוטר 90 מילימטר. השאירו להקשיה למשך 48 שעות בטמפרטורה של 65 °C, תוך וידוא שהצלחת מונחת בצורה אופקית באמצעות פלס בועות.
ניתן לבצע שלב זה באמצעות מכשיר spin coder אם הוא זמין. בצעו DGAs והקשיה כפי שהודגם קודם לכן. כעת, גזרו בעדינות את שכבת הזרימה של המכשיר המיקרופלואידי לגודל הרצוי באמצעות מחורר ביופסיה (biopsy puncher).
צרו חורים עבור הכניסות והיציאות בשכבת הזרימה. כמו כן, גזרו שכבת בארות בגודל דומה מהצלחת פטרי השנייה והניחו אותה על זכוכית עבה. החליקו מעל פריסת התכנון.
לאחר מכן, פנצו בארים בהתאמה למיקרוchannels במערך באמצעות אתנול, נקו את שתי שכבות ה-PDMS ואת כיסוי הזכוכית והניחו אותם להתייבש באוויר. בשלב הבא, טפלו בכיסוי הזכוכית ובשכבת ה-PDMS של הבארים באמצעות מכשיר plasma etcher סטנדרטי להדבקה בלתי הפיכה, או corona treater ידני להדבקה הפיכה. הניחו בזהירות את שכבת הבארים מעל כיסוי הזכוכית כדי ליצור הידבקות.
יש לשפשף בעדינות כדי להוציא בועות אוויר. הכינו את המדיום הרצוי במזרקים מתאימים וחברו אותם לצינור tigon המועבר דרך משאבת מזרקים. לצילום תאים.
השתמשו בחוזקים. עברו לשלב הרצוי, ערבבו את התרבית היטב באמצעות Vortex, והעבירו 300 µL למבחנות מיקרו-צנטריפוגה. הניחו בעדינות 1 µL של con canna A לכל באער בשכבת באערי ה-PDMS.
שטפו עודפי concanavalin A מכל באר פעמיים על ידי פיפטינג עדין של מים בזמן שה-concanavalin A מתייבש. שטפו את הזנים פעמיים עם 300 µL של מצע SC ללא גלוקוז. שטיפת שאריות גלוקוז מדפנות התאים מסייעת להיצמדות תקינה ל-conval.
לאחר ערבול (vortexing), העבירו באמצעות פיפט כ-0.5 µL מתחילת תרחיף התאים לתוך בארות בודדות. שטפו בעדינות תאי שאריות באמצעות מצע עשיר. את שני השלבים הבאים יש לבצע במהירות כדי למנוע מהתאים להתייבש.
כשלב אופציונלי, בצעו טיפול בפלזמה לשבב ולבארות, תוך הקפדה לא לפגוע בבארות באופן ישיר. לאחר מכן, תחת סטריאוסקופ, מקמו בזהירות את השבב על הבארות תוך תשומת לב רבה ליישור ביניהן. לחצו בעדינות כדי להדביק את שתי שכבות ה-PDMS.
מלאו באיטיות את המכשיר באופן מלא עם כ-50 µL של מצע עשיר, תוך וידוא שלא נותרו בועות אוויר בתוך התעלה. כעת חברו את המכשיר על ידי הכנסת הצינורות לכניסות המתאימות והתחילו את זרימת המצע. הקפידו שלא ייווצרו בועות אוויר בצינורות, שכן אלו עלולות להיתקע במכשיר ולפגוע בזרימה.
המשיכו להנחת המכשיר תחת מיקרוסקופ ואתרו נקודות דימוי מתאימות בכל באר. השאירו את התאים תחת זרימה של מצע עשיר למשך שעה אחת או יותר במידת הצורך, כדי לאפשר התאוששות.
התחילו את הניסוי עם הגדרת זרימה קבועה. הגדירו את משאבה A ל-0.8 milliliters per hour ואת משאבה B ל-0.2 milliliters per hour. עבור המדיום, הגדירו זרימה המכסה מעל 80% מרוחב התעלה.
ניתן לשנות באופן דינמי את התנאים במכשיר על ידי שינוי קצבי הזרימה היחסיים. התנאים החדשים מתייצבים בתוך שניות לאורך כל התעלה. כדי להדגים את ההפרדה בין זנים שונים, צולמו שני זני שמרים שניתן להבחין ביניהם בבארות לסירוגין.
שימו לב כי בניסוי זה אין דליפה של תאים בין הבארות. לשני הזנים יש את גורם השעתוק MSN2 המסומן ב-YFP, כדי לבחון את ההשפעה הסימולטנית של תנאים המשתנים באופן דינמי. קצבי הזרימה בשני ערוצי הכניסה שונו כדי ליצור שלב של מצע ללא גלוקוז.
דבר זה הוביל למיקום של MSN two בגרעין. חשוב לציין כי ניתן לנתח את מסלול הזמן של רמות MSN two YFP בגרעין בתאים בודדים. לפיכך, ניתן להשתמש במכשיר המיקרופלואידי מ-PDMS להחלת תנאים דינמיים בו-זמנית למספר בארות.
במהלך ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור למנוע את התייבשות התאים במהלך הרכבת המכשיר. לאחר רכישת מיומנות בטכניקה זו, ניתן לבצעה בקלות ללא צורך בליתוגרפיה רכה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לדימות התנהגותן של תאי שמרים בודדים מזנים שונים תחת תנאים דינמיים זהים באמצעות התקן מיקרופלואידי. ההתקן תוכנן למנוע זיהום צולב תוךما אפשרות לצפייה במספר זנים בו-זמנית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרופלואידיקה
- דימות תאים
- ביולוגיה של שמרים
רקע
- הבנת התנהגות התאים תחת תנאים דינמיים היא קריטית למגוון מחקרים ביולוגיים.
- שיטות מסורתיות דורשות לעיתים קרובות סביבת חדר נקי וטכניקות ייצור מורכבות.
- מחקר זה נועד לפשט את התהליך תוך שמירה על תקינות הניסוי.
- מכשירים מיקרופלואידיים מאפשרים בקרה מדויקת על התנאים הסביבתיים במחקרי תאים.
מטרת המחקר
- פיתוח התקן מיקרופלואידי המאפשר דימוי של מספר זני שמרים בו-זמנית.
- החלה של תנאי זרימה דינמיים על זנים שונים ללא זיהום צולב.
- שיפור ההבנה של תגובות תאי השמרים לשינויים סביבתיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור של התקן מיקרופלואידי דו-שכבתי.
- הצבה של זני שמרים שונים בבארות נפרדות של ההתקן.
- החלה של תנאי זרימה דינמיים באמצעות קצבי זרימה מבוקרים.
- דימוג של תגובות תאים לשינויים במצע.
תוצאות עיקריות
- המכשיר שמר בהצלחה על הפרדה בין זני שמרים שונים.
- הדמיה חשפה תגובות מובחנות של זני השמרים לאותם תנאים דינמיים.
- השיטה הראתה יתרונות על פני מערכות קיימות מבחינת פשטות ויעילות.
- לא נצפתה זיהום צולב בין הבארות במהלך הניסויים.
מסקנות
- התקן מיקרופלואידי זה מספק גישה חדשנית לחקר זני שמרים מרובים.
- השיטה מאפשרת ניסוי מבוקר ללא צורך במערכים מורכבים.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב לסוגי תאים ותנאי ניסוי אחרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
ניתוח השוואתי של מספר זני תאים תחת תנאים דינמיים זהים הוא קריטי לגילוי מוקדם ותיקוף מטרות במחקר ופיתוח בביופארמה. התקן המיקרופלואידי הזה מאפשר דימות סימולטני, ללא זיהומים, של זני שמרים נפרדים, ובכך תומך בבדיקת השערות חסונה ובצמצום סיכונים מכניסטיים. הייצור הנגיש שלו והבקרה הדינמית מייעלים את זרימות העבודה בנקודות מפתח במסלול הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר השוואה ישירה של תגובות תאיות בין מספר זנים תחת שינויים סביבתיים מבוקרים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי בידוד פנוטיפים ספציפיים לזן בתוך הקשר דינמי משותף.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי ביטול השונות הסביבתית כגורם משבש.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות ונקיות מזיהומים עבור בדיקות כמותיות בהמשך התהליך.
- מבצע סטנדרטיזציה של החשיפה הסביבתית, ובכך משפר את השחזוריות ואת מהימנות הבדיקה.
- מאפשר דימות בעל תוכן גבוה (high-content imaging) ותצפיות רב-ערוציות (multiplexed readouts) עבור תהליכי סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה תנאי ניסוי לגילוי סמנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים בעת שימוש במודלים של שמרים הרלוונטיים למחלה.
- שומרת על רציפות משלב הגילוי המוקדם ועד לאישור פרה-קליני על ידי תמיכה בהפרעות דינמיות עקביות.
- מפחיתה את הסיכון לתוצאות חיוביות שגויות על ידי הבטחת אחידות סביבתית בין זנים שונים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
מכשיר זה משתלב ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לניתוח כמותי מקבילי של מספר זנים תחת תנאים דינמיים מסונכרנים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי בקרת משתנים סביבתיים בין זנים שונים.
- סריקה: מספק מערכות הניתנות לשחזור ומוכנות לבדיקה עבור סריקה של תרכובות או סריקה גנטית.
- אנליטיקה: מספק פלטי דימות כמותיים בעת רב למשם השוואה סטטיסטית חסונה.
- מחקר תרגומי: מקל על התאמת סמנים ביולוגיים והמשכיות מכניסטית כאשר הדבר רלוונטי למודלים של מחלות המבוססים על שמרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמה ניתנת להרחבה ולקירור פשוט, הניתנת להתאמה לפאנלים מגוונים של זנים ולתכנונים ניסויים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בניבויים ומפחית עמימות מכניסטית במחקרים השוואתיים.
- ערך תפעולי: מפשט את ייצור המכשירים ומנרמז את ההגדרות הניסיוניות בין מעבדות שונות.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות (go/no-go) על ידי היתמכת השוואות מאמץ כמותיות וישירות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים באמצעות הבהרה של תגובות ספציפיות לזן תחת תנאים אחידים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהרכבה מיקרופלואידית ובדימוי תאי כמותי.
- נדרשת גישה לכלים בסיסיים לייצור PDMS ולתשתיות מיקרוסקופיה סטנדרטיות.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית של פרמטרי זרימה סביבתית בין צוותים.
- ניתן להתאמה למערכות מודל אחרות בעלות תכונות גודל והיצמדות דומות.
- מגבלות מעשיות כוללות אילוצי תפוקה ושלבי יישור ידניים.
