הלבלב Murine איילט בידוד
22 באוגוסט 2007
שלום, אני גרג זוט. אני ממרכז הסוכרת של UCSF במעבדת בלוסטון, והיום אראה לכם את התהליך לבידוד אeillets של עכבר. הפרוצדורה כוללת הזרקה של תמיסת קולגנאז ללבלב של עכבר תורם מסוג C3 H, לאחר מכן נסיר את הלבלב, נבצע עיכול אנזימטי, נטהר את ה-eyelets באמצעות מדרג פיאל (fial gradient), ולאחר מכן נבחר אותם ידנית להשתלה סופית בקפסולת הכליה של עכבר NOD עם סוכרת, שישמש כמעתמד.
לפני תחילת הפרוצדורה, דללנו את תמיסת ה-ATE שלנו בבופר Hanks שעבר התאמה, וכיוונו את הריכוז באופן ספציפי לזן העכבר שבו אנו משתמשים, C3 H. מצאנו שעיכולים טובים יותר מתקבלים בתמיסת קולגןאז (collagenase) בריכוז 0.8 mgs per mil, ואנו נשתמש בה להזרקה לתוך התעלה המרה המשותפת כדי להרחיב את הלבלב. את הפרוצדורה היום יבצע Pavo Codre ממרכז הסוכרת. הוא יזריק את החומר, יפתח את העכבר, יחשוף את המעיים, ואז יזריק לתוך התעלה המרה המשותפת.
נרסס את העכבר באתנול כדי להשכיב את הפרווה, ולאחר מכן נוודא כי העכבר הומת כראוי באמצעות לחיצה על בהו ה toes. פאבו יפתח כעת את העכבר ויחשוף את המעי ואת הלבלב באמצעות חתך בקו האמצע. כמו כן, ייחתך הסרעפת כדי לוודא שהעכבר הומת.
לפני שנתחיל, ברצוני להצביע על כמה מהמבנים החשובים. הקיבה נמצאת כאן, כאשר הלבלב מחובר אליה מלמטה אל התריסריון ומעליו. זהו הכבד, שבו נמצאים כיס המרה וצינור המרה המשותף, שניתן לראות ממש כאן.
כעת, Pavo יבודד את המעי הדק ויאתר את נקודת הכניסה של צינור המרה המשותף למעי הדק. ברגע שהמעי חשוף, אנו מהדקים את שני צדדי צינור המרה המשותף באמצעות קלמפות יתוש (mosquito clamps). מצאנו כי פעולה זו מאפשרת ליותר קולגנאטים להגיע ללבלב, בעוד שקבוצות אחרות מנסות להציב את הקלמפה מעל צינור המרה המשותף.
מצאנו כי טכניקה זו טובה יותר במתן אפשרות לאנזים להיכנס ללבלב. זהו הליך עדין. יש להימנע מקריעת המעי.
יש להניח את התפסנים בעדינות משני צדי תעלת המרה המשותפת. כעת נאתר את כיס המרה, וברגע שכיס המרה יהיה חשוף, נשתמש בו כמדריך להזרקת הקולגנאז לתעלת המרה המשותפת. פאוול משתמש במחט במידה 30 עם מזרק של 5 cc המכיל 3 mL של תמיסת קולגנאז.
בעודו נכנס לתעלת המרה המשותפת, הוא מרחיב את התעלה באמצעות תמיסת קולגנאז, ולאחר מכן הוא מתקדם במורד תעלת המרה המשותפת עד להגעה לסמוך למעי. ובזמן ירידתו, תמיסות האנזים נשאבות ומוזרקות אל הלבלב. כעת, כאשר הלבלב מנופח בתמיסת קולגנאז, פאוול יסיר את התסמיכים (hemostats) ולאחר מכן יוציא את הלבלב מהעכבר, תוך כדי קריעה זהירה שלו מהמעי.
הוא מוציא אותו מהקיבה. אוקיי, ואז באמצעות הטחול כנקודת אחיזה, הוא מרים את הלבלב ולאחר מכן גוזר אותו באיטיות בצינור המרה המשותף, וזהו. הלבלב נחשף ואז הטחול מוסר, ושם הוא מסיר את רקמת המזנטריון, ולאחר מכן הלבלב מוצב בתמיסת collagenase בריכוז 2 mill בתוך מבחנה מזכוכית סטרילית ומוחזר לקירור על קרח.
את הלבלב המבודד שהנחנו בבקבוקוני הזכוכית נכניס כעת למקלחית מים בטמפרטורה של 37 מעלות למשך כ-17 דקות. הנחנו אותם במתקן קוני של 50 mil כדי למנוע מהם לצוף. ברגע שהם במקלחית, הטיימר מתחיל ותהליך העיכול מתחיל.
עם סיום זמן העיכול, מוציאים את המבחנות, ולאחר מכן מנערים אותן ומפרקים את התוכן בעדינות. ברגע שהרקמה מתחילה להתפרק, מניחים את המבחנה על קרח. מסנן סטרילי מונח מעל כלי בכר בנפח 400 ml המכיל באפר שטיפה.
לאחר מכן שופכים בזהירות את תג עיכול הלבלב דרך המסך אל תוך בופר השטיפה. למטרות הדגמה, המנדף כובה והזכוכית של המנדף הורמה כדי שנוכל לראות את הפעולות המבוצעות. לאחר ששופכים את תג עיכול הלבלב אל תוך הכלי, שוטפים את המבחנות עם אותו בופר שטיפה ושופכים את בופר השטיפה דרך המסך.
יש ברשותנו מזרק מלא במסיי גסילה. נשתמש בו כדי לשטוף בעוצמה את הרקמה דרך המסך. המטרה היא לשחרר כל עין (eyelet) רופפת שאינה קשורה למטריקס, תוך השארת הממברנות והרקמה שלא התעכלה על המסך.
בסיום שטיפת רקמה, זהו המראה הרגיל של סוף הפרוצדורה. רקמת הלבלב שנמצאת בתחתית המבחנה תועבר כעת לשני מבחנות קוניות של 50 ml, שם הרקמה תישטף, תעורבב באופן אחיד ולאחר מכן תחולק שווה בשווה כך שיהיה נפח משקע שווה בכל מבחנה. כעת שוטפים את הכוס עם תמיסת שטיפה נוספת.
שוטפים את הדפנות כדי להחזיר את כל הרקמה שנדבקה אל תוך הכלי. לאחר מכן, מחלקים את התוכן באופן שווה בין שני כלים, 50 mL בכל אחד. את המבחנות הקוניות ממלאים עד הסוף במקדם שטיפה (wash buffer).
הרקמה נהפכת מספר פעמים ואז מועברת לצנטריפוגה. זהו סבב מהיר. הצנטריפוגה מגיעה למהירות של 1,000 RPM ואז היא כובה.
הרקמה בשלב זה רגישה מאוד, ואין לדחוס אותה יתר על המידה. השפופרות מוסרות ונבצע את שלב השטיפה הזה שלוש פעמים נוספות. זהו סוף השטיפה השלישית.
מרכיבי השפופרת הקונית בנפח 50 ml מועברים לשפופרת קונית בנפח 15 ml וסובבים בצנטריפוגה במהירות של 1,000 RPM ולאחר מכן עוצרים. הנוזל העליון (supernatant) יוסר והחלק הראשון של ה-FI Call יחל. אנו נמצאים בשלב שבו בידינו משקע (pellet) של עיכול לבלב.
נשחזר את הרקמה כדי שתהיה רפויה מספיק ביחס למשקעים. נוסיף את מפל הגרדיאנט הראשון, שהוא 1 1 0 8. נוסיף 5 mL לכל מבחנה.
לאחר מכן מערבבים את המשקע היטב בכל אחד מהמדרגים. חשוב להשיג פיזור רקמות טוב במדרג הכבד ביותר. כעת נוסיף שכבה של 2 mL של דחיסות 1 0 9 6.
לאחר מכן, נוסיף מעל כך שכבה של 2 מיליליטרים בצפיפות 1 0 6 9, ומעליה שכבה בצפיפות 1 0 3 7. חשוב להימנע מערבוב השכבות בזמן הוספתן. כעת כל השכבות נוספו למבחנה.
ניתן לראות שכאן נמצא החלק העליון של 1 1 0 8, החלק העליון של 9 1 0 9 6, החלק העליון של 1 0 6 9 והחלק העליון של 1 0 3 7. ניתן להבחין שהרקמה כבר מתחילה לנוע לצפיפות המתאימה לה, עוד לפני ביצוע הסנטריפוגה. מביאים את מדרגי ה-fial למהירות של 1800 RPM למשך 15 דקות, וזכרו להשאיר את הבלם כבוי לאחר הוצאת המבחנות מהסנטריפוגה.
ניתן לראות שבין השכבה 0 0 9 6 לשכבה 0 0 7 ישנו פס יפה של רקמת איים (islet tissue). כעת מסירים את השכבה 0 3 7 כדי להסיר שאריות רקמה ו-DNA שייתכנו השתחררו במהלך העיבוד. באמצעות פיפט פסטור פלסטית סטרילית, הוא יסיר כעת את שכבת האיים ויעביר אותן לאنبוב קוני של 50 mil המכיל 25 mils של בופר שטיפה.
יש לבצע שלב זה במהירות מכיוון ש-fol רעיל לאיילטים. למעשה, הסרנו את כל השכבה 0 6 9 ו-0 9 6. פאבו חותך את החלק העליון של פיפטת הפלסטיק עבור המצע ושוטף אותה עם בופר שטיפה.
לאחר מכן סובבים את ה-eyelets בצנטריפוגה, בדומה לסבב הצנטריפוגה הקודם. מעלים את מהירות הצנטריפוגה ל-1,000 RPM, ולאחר מכן עוצרים ושואבים את הנוזל העליון (supernatant). את ה-eyelets ישטפו שלוש פעמים עם מדיום שטיפה.
כעת השלמנו את תהליך בידוד האישיות (islets); התחלנו מהעיכול, המשכנו למדרג צפיפות (gradient) ועד לאישיות המופקות לאחר השטיפה השלישית עם בופר השטיפה. לאחר מכן, השהינו מחדש את האישיות במצע RPMI והעברנו אותן לצלחת תרבית רקמות. אישיות אלו מוכנות כעת לבדיקות in vitro או להכנות in vivo, כגון השתקת אישיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
סרטון זה מדגים את תהליך בידוד איים של לנגיר מעכבירי עכבר תורם מסוג C3H. הפרוצדורה כוללת הזרקת קולגנאז, הסרת הלבלב וטיהור האיים לצורך השתלה בעכבר NOD סוכרתי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אנדוקרינולוגיה
- ביולוגיה של השתלות
רקע
- השתלת איים היא טיפול פוטנציאלי לסוכרת.
- בידוד של איי לבלב מחייב עיכול אנזימטי ספציפי.
- קולגנאז (Collagenase) משמש באופן נפוץ לבידוד איים (islet isolation).
- מודלים של עכברים נמצאים בשימוש תכוף במחקרים על סוכרת.
מטרת המחקר
- להדגים שיטה מהימנה לבידוד איים של עכבר.
- להכין איים להשתלה במקבלים סוכרתיים.
- להגביר את ההבנה של תפקוד האיים וחיוניותם לאחר הבידוד.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הזרקת תמיסת קולגנאז ללבלב.
- הוצאה ועיכול של הלבלב.
- טיהור של איים באמצעות מדרג Ficoll.
- בחירה ידנית של איים להשתלה.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של איי לבלניק מהלבלב.
- איי לבלניק שהוכנו להשתלה הראו חיוניות.
- השיטה הוכיחה יעילות עבור מחקרים עתידיים.
- פוטנציאל לשיפור הטיפול בסוכרת באמצעות השתלה.
מסקנות
- השיטה המתוארת יעילה לבידוד איים של עכברים.
- השתתלת איים יכולה להוות אפשרות רלוונטית עבור מודלים של סוכרת.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על טכניקת בידוד זו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד של אילי לבלבל תפקודיים ממודלים עכבריים מאפשר הערכה פרה-קלינית של טיפולים לסוכרת ואסטרטגיות רגנרטיביות. טכניקה זו תומכת בתיקוף מטרות במחלות מטבוליות על ידי אספקת מערכת רלוונטית למחלה להערכת הפרשת אינסולין, חיוניות השתל והתערבויות אימונו-מודולטוריות. תנובת איים אמינה מגבירה את הביטחון החזוי בזיהוי מולקולות מובילות ובצמצום סיכונים פרה-קליני עבור גישות מבוססות השתלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות בהומיאוסטזיס של גלוקוז ובתפקוד תאי בטא באמצעות אילי לבלב ראשוניים של עכברים.
- ערך תפעולי: מספק מקור סטנדרטי של רקמה ראשונית למחקרי מעורבות מטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מספק איים מטוהרים המתאימים לבדיקות תפקודיות למדידת הפרשת אינסולין וחיוניות תאיות.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות הכנה עקבית של הרקמה וטיהור במדרג צפיפות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מסייע בהערכת יעילות השתלת איים בלבלב במודלים של עכברי NOD עם סוכרת.
- ערך תפעולי: מאפשר רצף משלב הבידוד ועד למחקרי השתבצות, ובכך תומך בתיקוף של מודלים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי על ידי אספקת רקמות ראשוניות מאושרות לצורך תיקוף מטרות, פיתוח בדיקות ומחקרי השתקה פרה-קליניים בחקר הסוכרת.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על תפקוד איים, הישרדות ותגובה למודולטורים חיסוניים או תרכובים רגנרטיביים.
- סריקה: מאפשרת הכנה הדירה של איים עבור קריאות תפקודיות ברמת דיוק גבוהה במערכי סריקה של תרכובים.
- אנליטיקה: מייצרת פלטים כמותיים כגון שחרור אינסולין ומדדי חיוניות לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין הבידוד לתיקוף פרה-קליני באמצעות השתלה לנRecipientים סוכרתיים, תוך הערכת תפקוד השטבל וסבילות חיסונית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת יכולת הדירה להפקה של איים רלוונטיים למחלה עבור מספר תוכניות טיפוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק ביטחון חיזוי בתיקוף המטרה באמצעות רקמה ראשונית הרלוונטית למחלה.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות וסטנדרטיזציה בבידוד איים באמצעות עיכול בקולגנאז וטיהור במדרג Ficoll.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי הפחתת אי-ודאות ביולוגית במודלים פרה-קליניים של סוכרת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של אסטרטגיות השתלה והתחדשות על בסיס תפקוד מאושש של האיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוחים בעכברים וטיפול ברקמות לצורך בידוד ועיכול של הלבלב.
- תלוי בהכנת תמיסת קולגנאז ובאופטימיזציה של הריכוז עבור זני עכברים ספציפיים.
- מחייב גישה לציוד צנטריפוגה לצורך הפרדה במדרג צפיפות ושלבי שטיפה.
- כולל שיקולי התאמה לווריאציות ספציפיות לזן בגודל הלבלב וביעילות העיכול.
- מוגבל על ידי רגישות הרקמה במהלך העיבוד, מה שדורש טיפול עדין כדי לשמר את חיוניות ותפקוד האיים.
