העכבר איילט בידוד נגרהנס באמצעות שילוב של collagenase המטוהר ופרוטאז הניטראלי
7 בספטמבר 2012
תיאור מפורט של בידוד איון עכבר מתואר באמצעות הטכניקה של cannulation באתר הלבלב ductal וטפטוף של שילוב של מטוהר collagenase ופרוטאז הניטראלי.
המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד בהצלחה אילי לבלב (eyelets) מלבלב של עכבר. הדבר מושג תחילה על ידי בידוד הלבלב מהרקמה שסביבו. לאחר מכן, מבוצע קנולציה של צינור המרה כדי שניתן יהיה לנפח את הלבלב באמצעות תערובת של קולגנאז ופרוטאז.
לאחר הניפוח, הלבלב מוסר ואיילטי הלבלב (eyelets) מופרדים בזהירות. לבסוף, האיילטים המבודדים מסוננים ומונחים בצלחות לשימוש עתידי. בסופו של דבר, שיטה זו לבידוד איילטים באמצעות קולגנאז מטוהר ופרוטאז ניטרלי משמשת להשגת תנובת איילטים מקסימלית ומורפולוגיה אופטימלית של האיילטים.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות לבידוד איים של לבטא (eyelets) הוא שביטלנו את השונות בין סדרות באמצעות שימוש באנזימים מטוהרים. בנוסף, ביצענו שינויים או שיפורים בחלק מהפרוטוקולים כדי לשפר את המורפולוגיה של האיים. לאחר ההמתה, כסו את פלג הגוף העליון ב-70% ethanol לפני פתיחת חלל הבטן באופן מלא, מהפיחר ועד לסרעפת.
לאחר מכן, הניחו את העכבר על פלטפורמת מיקרוסקופ ניתוח. משכו החוצה את המעי העיוור ואת המעי הגס העולה והניחו אותם מחוץ לחלל הגוף משמאל; הזיזו את אונוי הכבד לכיוון הסרעפת. אם הם אינם נשארים שם מעצמם, הגדילו את פתיחת חלל הגוף.
תפסו את התריסריון בעזרת פינצטה מעוקלת ואתרו את צרור העורק הכבדי, הווריד הפורטלי וצינור המרה המובילים לכבד. בעזרת זוג נוסף של פינצטות מעוקלות, השחילו תפר מתחת לצרור העורק, הווריד והצינור, והדקו אותו קרוב ככל האפשר לכבד.
באמצעות שני זוגות של פינצטות מעוקלות, תפסו בזהירות את התריסריון ואתרו את צינור המרה המחובר לפפילה. השתמשו בפינצטה אחת כדי לדקור דרך הלבלב והרקמה החיבורית, ממש מתחת לצינור המרה ובסמיכות לפפילה. במהירות, העבירו את הפינצטה דרך החור והשחילו תפר. קשרו את התפר באופן רפוי סביב צינור המרה כדי ליצור עיגול קטן, בעזרת פינצטה של 90 מעלות.
משכו את המעי הדק עד אשר צינור המרה יהיה מתוח. בצעו חיתוך אופקי אחד לרוח הפפילה באמצעות מספריים עדינים במיוחד, ללא תלישת צינור המרה מהפפילה, תוך כדי החזקת המעי. הכניסו קנולה לתוך צינור המרה ולאחר מכן משכו בעדינות את התפר כדי להדק אותו סביב הקנולה.
בשלב הבא, מלאו מזרק של שלושה מיליליטר ב-2.0 milliliters של תערובת קולגנאז פרוטאז. מזריקו תערובת זו לתוך הקנולה בקצב איטי וקבוע. לאחר השלמת ניפוח הלבלב, הוציאו את הקנולה מתוך צינור המרה.
החל מהמעי הגס היורד, גזרו את הרקמה החיבורית תוך כדי משיכה של המעיים למעלה עד להגעה לצינור המרה. לאחר מכן, הפרידו את הלבלב מהטחול ומרקמות סביבותיו. לבסוף, גזרו את התפרים והוציאו את הלבלב.
לאחר ההוצאה, העבר את הלבלב למבחנה של 50 milliliter המכילה 5 milliliter של HBSS על קרח. לאחר איסוף כל הדגימות, הנח את מבחנות ה-50 milliliter המכילות רקמת לבלב בתוך מקלח מים בטמפרטורה של 37 degree Celsius. במשך 15 דקות, נער את המבחנה בעדינות ובדוק אם חלה דיסוציאציה של הרקמה.
וודאו שהרקמה נפרדת בקלות תוך כדי החזקת המבחנה במכסה. סובבו את המבחנה 12 פעמים כדי להגביר את הדיסוציאציה של הרקמה. הוסיפו לא יותר מ-30 milliliters של HBSS וסבבו בצנטריפוגה.
שאבו את הנוזל העליון (supernatant) בזהירות והשאירו כמות קטנה בתחתית כדי לא לפגוע במשקע התאים. באמצעות מזרק של 30 milliliter המחובר למחט gauge 14, הוסיפו לא יותר מ-10 milliliters של HBSS ושאבו את התסמין למעלה ולמטה פעמיים. סננו את תערובת התאים דרך מסננת T מפלסטיק לתוך מבחנה של 50 milliliter.
שטפו עם 10 מיליליטר נוספים של HBSS וסובבו בצנטריפוגה. שפכו את העלייה (supernatant) והפכו את המבחנות כדי לנקז נוזלים על נייר סופג למשך דקה אחת. השביו את התוכן של כל מבחנה ב-10 מיליליטר.
קירור ל-1100. הכיסוי העמום שלו, העמום שלו עם 10 מיליליטר של HBSS וסנטריפוגה. הסר את כל 20 המיליליטר של העליון (supernatant) באמצעות פיפט של 25 מיליליטר בעל פיה רחבה והעבר את העליון דרך מסנן הפוך של 70 מיקרון.
סננו את ה-eyelets ישירות לתוך צלחת פטרי ושטפו על ידי העברת 10 milliliters של מצע גידול ל-eyelets דרך תרבית הסינון. השאירו את ה-eyelets באינקובטור לתרביות רקמה עד למועד הניסוי. תנובת ה-eyelets, המורפולוגיה והאיכות הם הפרמטרים הכלליים המשמשים להערכת הצלחת בידוד ה-eyelets.
כאן מוצג מורפולוגיה טיפית של אילי שלטון (eyelets). לאילי השלטון צורה עגולה עד מוארכת עם גודל אחיד יחסית. כאן, אילי שלטון מבודדים נותחו עבור הפרשת אינסולין המעוררת גלוקוז.
הגירוי של אינסולין היה דומה בין איים שהוכנו באמצעות Sigma Type 11 בהשוואה ל-ci zyme TM, MABP, מה שמעיד על איכות גבוהה של הכנת האיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הקנולציה של תעלת המרה בעכבר. השתמשו ב-zyme collagenase וב-neutro proteases כדי לבודד את האיים עבור כל בדיקה.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידוד איי לングרהנס מבלטעת של עכבר באמצעות קניולציה של תעלת הלבלב in situ ותערובת של קולגנאז-פרוטאז. שיטה זו נועדה לשפר את תנובת איי הלנגרהנס ואת המורפולוגיה שלהם תוך מזעור השונות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- אנדוקרינולוגיה
רקע
- תאי אייlets (Islet cells) חיוניים לייצור אינסולין.
- שיטות בידוד מסורתיות עלולות להוביל לשונות בתוצאות.
- שימוש באנזימים מטוהרים יכול לשפר את איכות האייlets המבודדים.
- פרוטוקולים משופרים יכולים להוביל למורפולוגיה טובה יותר של האייlets.
מטרת המחקר
- לבידוד יעיל של איים (Islets) מלבלב של עכבר.
- להפחתת השונות בין סדרות של תכשירי אנזימים.
- לאופטימיזציה של מורפולוגיית האיים עבור יישומים מחקריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד הלבלב של עכבר מרקמות סביב.
- קנולציה של תעלת המרה להזרקת אנזימים.
- ניפוח של הלבלב באמצעות תערובת של קולגנאז ופרוטאז.
- סינון והסמקה של איים מבודדים לצורך ניסויים.
תוצאות עיקריות
- דיסוציאציה ובידוד מוצלחים של איים (eyelets).
- שיפור במורפולוגיה של האיים שנצפה לאחר הבידוד.
- הכנות איים באיכות גבוהה, כפי שהודגש בבדיקות הפרשת אינסולין.
- השיטה הדגימה שונות מופחתת בהשוואה לטכניקות מסורתיות.
מסקנות
- השיטה המתוארת יעילה לבידוד של eyelets באיכות גבוהה.
- שימוש באנזימים מופקים משפר את מהימנות התוצאות.
- טכניקה זו עשויה להועיל למגוון בדיקות הכוללות eyelets.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
בידוד של איים לבלב ראשוניים מאפשר הערכה רלוונטית פיזיולוגית של תפקוד תאי בטא, שהיא קריטית לאישוש מטרות טיפול בסוכרת ולהפחתת סיכונים מכניסטיים. שונות בביצועי מנות של אנזימים פוגעת ביכולת השחזור לאורך קמפיינים של גילוי, ובכך משפיעה על זיהוי מועמדים תרופתיים ועל רמת הביטחון בניבויים. פרוטוקול זה מטפל בחוסר עקביות בין מנות באמצעות קולגןאז purified ופרוטאז ניטרלי, ובכך תומך בהכנה סטנדרטית וניתנת להרחבה של איים לבלב לצורך הערכה פרה-קלינית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקר של מסלולי איתות תוך-תאיים ותגובות הפרשה באיים ראשוניים, ובכך משפר את תיקוף היפותזות לגבי מטרות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מפחית רעש ביולוגי הנובע משונות אנזימטית, ובכך מגביר את הביטחון בקריאות של מעורבות המטרה (target engagement).
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מספק תבואה ומורפולוגיה עקביות של אי islets לצורך בדיקות מהימנות של הפרשת אינסולין בהשראת גלוקוז.
- ערך תפעולי: הרכב אנזימטי סטנדרטי תומך בחזרתיות של הבדיקה בין מעבדות שונות ובמסעות סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על ביולוגיה של תאי בטא הרלוונטית למחלה לצורך מחקרי יעילות ורעילות פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: מאפשר השוואה בין זנים כאשר יחסי האנזימים מותאמים למאפייני רקמה ספציפיים למין.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, שבה תפקוד האי islets הראשוני מכוון את ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go).
- ביולוגיית גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות תגובות של איים דמויי-אנוש הרלוונטיות פיזיולוגית.
- סריקה: מאפשרת הערכה כמותית וסטנדרטית של השפעות תרכובות על הפרשת אינסולין.
- אנליטיקה: מייצרת משתנים תלויים מדידים, כגון רמות הפרשת אינסולין ותשואת איים, לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מודולציית מטרות בשלב הגילוי לבין תוצאות פרה-קליניות באמצעות שימור המורפולוגיה והתפקוד של האיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מנות של אנזימים מופקים מאפשרות שימוש חוזר בפרוטוקול לאורך פרויקטים שונים, ובכך מפחיתות את נטל האופטימיזציה מחדש.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי בתיקוף המטרה באמצעות הפחתת עמימות מכניסטית בתגובות של תאי בטא.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של בידוד איים הלבלב בין אתרים ומחקרים שונים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות "המשך/עצור" (go/no-go) טובה יותר, יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות למטפל בסוכרת.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכון המבוסס על נתונים תפקודיים מהימנים המופקים מאיים הלבלב.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנתיחה של עכברים ובקנולציה של תעלת הלבלב.
- תלוי בגישה לקולגנאז מופרק (CIzyme MA) ופרוטאוז ניטרלי (CIzyme BP) בעלי פעילות מאופיינת.
- מחייב סטנדרטיזציה של יחסי האנזימים (למשל, 35:10 קולגנאז:פרוטאוז) לביצועים עקביים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור זנים שאינם C57BL/6 או עבור מודלים של חולדות, בהתאם לצפיפות הרקמה ולנגישות האנזימטית.
- מגבלה מעשית: שלבי הנתיחה והניפוח הידניים מגבילים את התפוקה ללא אוטומציה.
