ניטור שינויים דינמיים רמות הסידן מיטוכונדריאלי במהלך אפופטוזיס באמצעות חיישן סידן מקודד גנטית
1 באפריל 2011
פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידת זמן אמת של והנתיבים סידן המיטוכונדריה ידי דימות פלואורסצנטי. השיטה מנצלת את חיישן YFP מבוססי permutated מעגלית סידן עירור כפול ratiometric (ratiometric pericam-MT) הביע סלקטיבי במיטוכונדריה.
המטרה הכללית של הליך זה היא לנטר שינויים בריכוז הסידן המיטוכונדריאלי בתאים חיים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי טרנספקציית תאים עם חלבון מדעי (ratiometric) של אינדיקטור לסידן, peram, המכוון למטריקס המיטוכונדריאלי, יום או יומיים לאחר הטרנספקציה. מיקרוסקופ הפלואורסצנציה והתוכנה מוגדרים לדימות תאים חיים.
לאחר מכן, נרכשות תמונות של תאים המבטאים חלבון PERAM רציומטרי עם הוספה של אגוניסט המגייס סידן. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ניתוח כמותי של התמונות שנרכשו. לבסוף, ניתן להשיג תוצאות המראות שינויים דינמיים בריכוז הסידן במיטוכונדריה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תאים חיים המבטאים חלבון אינדיקטור רציומטרי לסידן.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מדידת רמות סידן באמצעות אינדיקטורים סינתטיים לסידן, הוא ש-ratio metric peram מקודד גנטית ולכן ניתן לכוון אותו למיטוכונדריה או לכל אברון אחר בעל עניין. שלום, אני ד"ר Ascar, פוסט-דוקטורנט במעבדתו של ד"ר Benning, והיום אדגים את הפרוצדורה. כדי להתחיל בפרוטוקול, יש לזרוע תאי HeLa בערב שלפני כן, לצורך טרנספקציה על לבישי זכוכית סטריליים המונחים בתוך פלטת תרבית סטנדרטית של שש בארות, בצפיפות שתהיה כ-70% confluent במועד הטרנספקציה למחרת. למחרת, הכינו קומפלקסים של DNA Lipofectamine 2000 לפי הוראות היצרן, עם 4 µg של וקטור ביטוי מיטוכונדריאלי של metric peram, ו-10 µL של Lipofectamine 2000 המדוללים ב-0.5 mL של Opti-MEM עבור כל בארה המיועדת לטרנספקציה.
בשלב הבא, החליפו את מצע התרבית D-M-E-M-F-B-S HELOC בכל באר ב-1.5 milliliters של אותו מצע ללא אנטיביוטיקה. הוסיפו את תמיסת ה-LIPECTOMY לתמיסת ה-DNA וערבבו בעדינות לאחר שנוצרו הקומפלקסים. הוסיפו את תמיסת ה-DNA Lipectomy בטיפות לכל באר המיועדת לטרנספקציה, ערבבו על ידי נעירוה עדינה של הפלטה והדגרימו למשך ארבע שעות באינקובטור לתרביות תאים בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide לאחר ההדגירה.
החליפו את המצע ב-D-M-E-M-F-B-S המכיל אנטיביוטיקה. אפשרו לתאים לבטא את metric peram למשך יום עד יומיים לפני הדמיה באמצעות פינצטה. הניחו בעדינות זכוכית כיסוי עם תאי HELOC לתוך תא הדמיה מתאים עם תמיסת הדמיה.
התקינו את תא הדמיה על במה של מיקרוסקופ הפוך. לאחר מכן, השתמשו בעדשת שימור בשמן (oil immersion objective) בהגדלה של 40 x או יותר ובאורך גל של 380 nanometers. כדי למצוא אזור עניין המכיל תא אחד או יותר המבטאים PERCAM ratio metric, נעשה שימוש כאן ב-380 nanometers לצורך זיהוי התאים כ-ratio metric.
Peram פחות עמיד להבהרה פוטו-כימית (photobleaching) באורך גל זה. לאחר זיהוי האזור המבוקש, הגדירו את התוכנה לעירור כפול ב-495 וב-380 ננומטר. לאחר מכן, רכשו תמונות באופן סדרתי על ידי עירור לסירוגין ב-495 וב-380 ננומטר.
רכשו תמונות של רמות הסידן הבסיסי למשך 30 שניות לפחות לפני יישום האגוניסט. לאחר מכן, יישמו את האגוניסט המגייס סידן באמצעות מכשיר פרופוזיה (profusion apparatus), תוך רישום זמן ההוספה עבור כל חשיפה לאגוניסט; יש לאופטימיזציה של זמני החשיפה ומרווחי הרכישה כדי למנוע פוטו-بلیצ'ינג (photo bleaching) ועדיין לאפשר רזולוציה זמנית מספיקה. עם השלמת הניסוי, ניתן לנתח את התמונות באופן לא מקוון.
כדי להתחיל בניתוח, בחר אזור עניין (ROI) בתוך שטח ריק בשדה כדי להפחית פלואורסצנציית רקע במידת הצורך. לאחר מכן, ייצא את מדידות היחס 4 95 3 80 מאזור העניין ל-Excel או לתוכנת גרפים דומה. פאנל תמונות זה מציג את הלוקליזציה התת-תאית של peram ומיטוכונדריה בשיטה רציומטרית.
משמאל מוצגת תמונת תא חי של תאי hela המבטאים ratio metric peram. במרכז מוצגת צביעה פלואורסצנטית של המיטוכונדריה באמצעות הצבע הסלקטיבי MIT tracker red CMX Ross. ולבסוף מימין, התמונה המאוחדת המוצגת כאן היא סדרה של תמונות ratio בצבעי פסאודו של 495, 380 nanometer של ארבעה תאי hela המבטאים ratio metric peram במיטוכונדריה שטופלו ב-10 micromolar ATP, והכמות של השינויים ברמות הסידן המיטוכונדריאליות של ארבעת התאים הללו מוצגת כאן בתמונה זו של תא hela המבטא ratio metric peram במיטוכונדריה.
הטרוגניות בתגובת הסידן במיטוכונדריה בודדות, כמו כן פרגמנטציה משמעותית של המיטוכונדריה, ניכרת לאחר 60 דקות של טיפול ב-0.5 µM staurosporine. חלק מהמיטוכונדריה מראות עליות תנודתיות בסידן, כפי שמוצג באמצעות החץ הלבן, בעוד שאחרות אינן מראות שינויים משמעותיים ברמת הסידן, כפי שמוצג באמצעות החץ הצהוב. גרף זה חושף את השינוי ברמות הסידן המיטוכונדריאליות הגלובליות בתא HeLa בודד לאחר השראת אפופטוזה למשך 120 דקות עם 0.5 µM staurosporine.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן למדוד שינויים דינמיים ברמות הסידן המיטוכונדריאליות בתגובה לגירויים שונים, באמצעות חלבון R geometric peram המתווך סידן, המכוון באופן סלקטיבי למטריקס המיטוכונדריאלי.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה למדידה בזמן אמת של תדלוקי סידן מיטוכונדריאליים באמצעות אינדיקטור סידן מקודד גנטית, ratiometric pericam-mt. טכניקה זו מאפשרת ניטור דינמי של רמות הסידן בתאים חיים, ומספקת תובנות לגבי התפקוד המיטוכונדריאלי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- דימות פלואורסצנציה
רקע
- רמות הסידן המיטוכונדריאליות הן קריטיות למטבוליזם ולסיגנלינג תאי.
- שיטות מסורתיות למדידת רמות סידן מסתמכות לרוב על אינדיקטורים סינתטיים.
- אינדיקטורים מקודדים גנטית מציעים יתרונות בספציפיות ובמיקוד.
- מחקר זה עושה שימוש ב-pericam-mt רציומטרי לצורך הדמיה משופרת של דינמיקת סידן מיטוכונדריאלית.
מטרת המחקר
- לניטור שינויים בריכוז הסידן המיטוכונדריאלי בתאים חיים.
- להדגמת השימוש במדד סידן מקודד גנטית המכוון למיטוכונדריה.
- לספק פרוטוקול מפורט لديמות ואנליזה של זרמי סידן מיטוכונדריאליים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טרנספקציה של תאים ב-ratiometric pericam-mt.
- דימוי תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- עירור רצופי באורכי גל כפולים למדידת סידן.
- ניתוח כמותי של תמונות פלואורסצנטיות להערכת דינמיקת הסידן.
תוצאות עיקריות
- נמדדו בהצלחה שינויים דינמיים ברמות הסידן המיטוכונדריאליות.
- נצפתה הטרוגניות בתגובות הסידן בין מיטוכונדריה בודדות.
- נרשמה פרגמנטציה משמעותית של המיטוכונדריה תחת טיפולים מסוימים.
- התוצאות הוכיחו את יעילותו של ratiometric pericam-mt לדימוי בזמן אמת.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לחקר דינמיקת הסידן המיטוכונדריאלית.
- אינדיקטורים מקודדים גנטית, כגון ratiometric pericam-mt, משפרים את יכולות הדימוי.
- ניתן להחיל טכניקה זו על תנאים ניסיוניים שונים כדי לחקור את התפקוד המיטוכונדריאלי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניטור דינמיקת הסידן המיטוכונדרי מספק תובנות מכניסטיות קריטיות לגבי מסלולי אפופטוזיס, ומאפשר תיקוף של מטרות במנגנוני מוות של תאים. גישה זו, המשתמשת בחיישן מקודד גנטית, תומכת בביטחון חיזוי במודלים פרה-קליניים על ידי כימות של שטפי סידן ספציפיים לאברונים ברזולוציה זמנית. השיטה מקלה על הפחתת סיכונים מוקדמת של היפותזות טיפוליות הכוללות תפקוד לקוי של מיטוכונדריה במודלים של מחלות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של סידן מיטוכונדריאלי כווסת של מסלולי אפוप्टוזה לצורך בדיקת היפותזות מטרות.
- ערך תפעולי: מספק קריאות ספציפיות לאברונים המפחיתות עמימות במחקרים מכניסטיים של מוות תאי.
- ערך ניבוי: תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות המעורבות באפוप्टוזה המתווכת על ידי סידן באמצעות מדידות שטף בזמן אמת.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר נתונים רציומטריים כמותיים המאפשרים ניתוח תגובה-מינון של תרכובות המשפיעות על סידן מיטוכונדריאלי.
- ערך תפעולי: תואם למיקרוסקופיית שדה רחב סטנדרטית, מה שמאפשר שילוב בפלטפורמות דימות קיימות ללא צורך בציוד ייעודי.
- ערך סקילביליות: מאפשר מעקב אורכי של דינמיקת סידן ומורפולוגיה מיטוכונדריאלית בתאים חיים לאורך שעות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר שינויים ברמת הסידן המיטוכונדריאלית לתוצאות אפופטוטיות, ובכך תומך ברלוונטיות של סמנים ביולוגיים במודלים של מחלות.
- ערך תפעולי: מדגים יעילות הן עם ATP (אגוניסט פיזיולוגי) והן עם סטאורוספורין (staurosporine, משרה אפופטוזה), ובכך מרחיב את הישימות למגוון תנאים ניסיוניים.
- המשכיות תרגומית: מסייע במעבר מגילוי מנגנונים לוולידציה פרה-קלינית על ידי אספקת מדדים דינמיים ורלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מאישור המטרה דרך הפחתת סיכונים מכניסטיים ועד להערכה פרה-קלינית, באמצעות אספקת נתונים דינמיים וכמותיים על תפקוד מיטוכונדריאלי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות של מסלולי אפו פטוזיס תלויי סידן באמצעות מדידות בזמן אמת של שטף מיטוכונדריאלי.
- סריקה: מאפשר מערכות מוכנות לבדיקה עם קריאות סידן סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור קמפיינים של סריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מספק פלטים רציומטריים כמותיים (יחס עירור של 495nm/380nm) המאפשרים השוואה סטטיסטית של דינמיקת סידן בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין שינויים ברמות הסידן המיטוכונדריאלי לבין פנוטיפים אפופטוטיים, ובכך תומך ברצף מהמנגנון ועד לתוצאה הפנוטיפית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת דימות הניתנת לשימוש חוזר למחקר של תפקוד לקוי של מיטוכונדריה במגוון תחומי מחלה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת העמימות המכניסטית במסלולי אפופטוזיס.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות אינדיקטורים מקודדים גנטית המכוונים לאורגנלה, המונעים דליפת צבע וארטיפקטים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת תובנות כמותיות מוקדמות לגבי מנגנונים מיטוכונדריאליים של פעולת תרכובות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של תרכובות מותאם סיכון על בסיס פרופילים של מודולציית סידן מיטוכונדריאלית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בביולוגיה מולקולרית לצורך טרנספקציה ודימוי של תאים חיים.
- תלוי במיקרוסקופיה פלואורסצנטית בעלת יכולת עירור כפולה (380nm ו-495nm) ובערכות מסננים סטנדרטיות.
- מחייב סטנדרטיזציה של פרוטוקולי רכישת תמונות וניתוח אזורי עניין (ROI) בין צוותים שונים.
- שיקולי התאמה כוללים את יעילות התargeting המיטוכונדריאלי וארטיפקטים פוטנציאליים של ביטוי יתר במודלים תאיים שונים.
- מגבלות מעשיות כוללות סיכונים לפוטובליצ'ינג במהלך דימוי לטווח ארוך וצורך באופטימיזציה של מרווחי החשיפה לאגוניסט.
