ביקע ניטור caspase-3 פעילות אפופטוזיס של תאים Oligodendroglial הונצח באמצעות Live-תא הדמיה Cleaveable Fluorogenic-צבע מצעים בעקבות שלילת קוטביות אשלגן-Induced ממברנה

נוהל זה מאפשר ניטור של מוות תאי גליא מסוג oligo DDR בזמן אמת. הדבר משיג תחילה על ידי תרביות של התאים, ולאחר מכן הכנת התאים לדימות תאים חיים. השלב הבא הוא מתן טיפול לתאים וניטור ההשפעות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

השלב הסופי הוא ביצוע ניתוח נתונים. בסופו של דבר, התוצאות מראות שיעורי מוות של תאים באוכלוסיית תאים בעקבות טיפול או גירוי, וזאת באמצעות ניטור פלואורסצנציה גרעינית מצבע פלואורסצנטי המופעל על ידי caspase. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון צביעה אימונולוגית, הוא היכולת לאסוף נתונים ממספר נקודות זמן בו-זמנית.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בביולוגיה של התא, כגון תגובות לטיפולים פרמקולוגיים, ריאגנטים וטיפולים שונים. כעת, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מוות בתרביות תאים. ניתן ליישמה גם במערכות אחרות כגון רקמות ex vivo ורקמות אורגנוטיפיות, כולל פרוסות מוח.

בדרך כלל, אנשים שאינם מורגלים בשיטה זו יתקשו בתחילה בעודם מסתגלים לעבודה עם רקמה חיה במקום רקמה מקובעת. הדגמה חזותית של טכניקה זו היא חשובה, שכן ישנם שלבים רבים יותר להכנת דגימות של תאים חיים בהשוואה לרקמה מקובעת. ראשית, הפשיתו תאי גליא מסוג N 19 oligo droog מומינליים קפואים באמבט מים בטמפרטורה של 37 °C בזמן שהתאים מפשירים.

הוסיפו שבעה milliliters של DMEM עם רמות גלוקוז גבוהים, מועשר ב-10% FBS ו-1% penicillin streptomycin, לצלחת תרבית של 10 סנטימטרים. לאחר מכן, הוסיפו את תרחיף התאים לצלחת בטיפות ונערו בעדינות את צלחת הפטרי כדי לפזר את התאים באופן שווה. דגרו את התאים בטמפרטורה של 34 degrees Celsius באינקובטור עם 5 אחוזי carbon dioxide למשך ארבע שעות.

שאבו את המצע מהפלטות כדי להסיר שאריות של DMSO. Cryoprotectant. החליפו בשבעה מיליליטרים של מצע טרי לאחר ארבעה עד שבעה ימי גידול. כאשר התאים הגיעו ל-70% עד 80% Confluence, שאבו את המצע וטפטפו באמצעות פיפטה מיליליטר אחד של drips על שכבת התאים, והדגירו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

לאחר מכן קצרו את התאים וזריעו אותם בצלחת תרבית רקמות של 10 סנטימטרים בצפיפות של 0.1 × 10⁶ תאים למילליליטר, והכניסו צלחת זו לאינקובטור לתרבית רקמות. לאחר מעבר נוסף, ניתן לזרוע את התאים לניסויי דימוי של תאים חיים. לצורך כך, קצרו את התאים כפי שנעשה קודם לכן, ואז הוציאו 30 µL מתלי התאים וספרו את התאים באמצעות המוציטומטר.

בשלב הבא, השתמשו בפינצטה סטרילית להנחת לוחות כיסוי מזכוכית ללא ציפוי. לתוך בארות של פלטת שש בארות, הוסיפו תאים בצפיפות של 0.1 × 10⁶ תאים למילליליטר. ב-2 mL של מצע DMEM high glucose נטול פנול, המועשר ב-10% FBS ו-1% penicillin streptomycin, אפשרו לתאים לגדול למשך לילה בטמפרטורה של 34 °C וב-5% carbon dioxide לפני הטרנספקציה.

למחרת, ערבבו 100 µL של מצע ללא סרום, 0.5 עד 4 µg של פלסמיד DNA מטוהר ו-4 µL של FUgene HD. ערבבו את התערובת בעדינות באמצעות וורטקס פעמיים, ולאחר מכן המתינו חמש דקות בטמפרטורת החדר להיווצרות קומפלקס ה-DNA. לאחר סיום זמן הדגירה, הוסיפו את תערובת ה-FUgene HD ו-DNA ישירות לתאי התרבית.

הט את הצלחת בעדינות כדי לערבב. לאחר מכן, דגרא את התאים למשך 48 שעות נוספות ב-34 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide לפני הטיפול או הניסוי. ראשית, הפעל את תיבת הבקרה של מכשיר ה-LCI Cham light live cell.

יש לבצע זאת שלוש שעות לפני תחילת הניסוי כדי להבטיח חימום יסודי של הבמה. לכל הפחות, יש להדליק את תיבת הבקרה שעה אחת לפני תחילת הניסוי. לאחר מכן, בעבודה תחת מנדף זרימה, יש לרסס את תא התרבית המגנטי מסוג LCI Cham light ואת הפינצטה ב-70% ethanol ולהמתין לייבושם במשך חמש דקות.

הוציאו את התאים מהאינקובטור ובחנו אותם תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהם בריאים. התאים צריכים להיראות שקופים ופרוסים היטב על ליתר הזכוכית, עם תהליכי ממברנה רבים. תאים עם מספר מופחת של שלוחות או גרעין בעל צורה לא סדירה הם ככל הנראה בסטרס כתוצאה מהטרנספקציה ואינם מתאימים לניסויים נוספים בתוך מabilis הזרימה.

הטו את הפלטה בעלת ששת הבארים והסר את לביבת הכיסוי באמצעות פינצטה. הנח במהירות את לביבת הכיסוי, כאשר צד התאים פונה כלפי מעלה, אל תוך הפלטה התחתונה של התא. אין לאפשר ללביבת הכיסוי להתייבש.

בשלב הבא, הצמידו את הגוף המגנטי הראשי של תא התרבית והוסיפו 500 µL של מצע גידול מהפלטה המקורית בעלת שש הלולאות אל חלקו העליון של לית לכיסוי (cover slip). שימוש חוזר במצע מפחית את רמת העקה המופעלת על התאים כתוצאה משינויים סביבתיים ויכול להועיל גם להערכת גורמים מופרשים חוץ-תאיים. לאחר הוספת המצע, הניחו את כיסוי הזכוכית על תא התרבית והשתמשו בנייר ניגוב מסוג Kim wipes עם 70% כדי להסיר מחלקו התחתון של לית לכיסוי כל שארית חומר שעלולה להפריע למיקרוסקופיה.

הניחו את תא התרבית באינקובטור בטמפרטורה של 34 degrees Celsius ו-5% carbon dioxide למשך 30 דקות. שלב זה יבטיח שתא התרבית עצמו יתחמם ל-34 degrees Celsius כדי להפחית את תזוזת זכוכית הכיסוי. בעוד המתחמם, יש להקפיד לעבוד בתאורה סביבתית נמוכה ככל האפשר במהלך השלבים הבאים.

ראשית, Thora הכינה מראש תמיסת elequa של nuke view בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוציאו את תא התרבית מהאינקובטור והניחו אותו במהירות בתא הסביבתי של המיקרוסקופ. הפעילו את מיכל הפחמן הדו-חמצני עם תערובת מוקדמת של 5% בעל רגולטור כפול.

בשלב הבא, השתמש בעדשה עם הגדלה של 10x, כאשר נורת המיקרוסקופ מכוונת למתח של כ-2.5 volts וזמן החשיפה הוא 240 milliseconds. בצע מיקוד באמצעות מיקרוסקופיה בשדה בהיר (brightfield microscopy) כדי להדמיות את התאים על מסך המחשב. לאחר מכן, הוסף לתאים ריכוז של 80 millimolar של יוני אשלגן או משרה אפופטוזיס אחר, באמצעות החלפת מדיום בפרפוזיה איטית ומקומית בעזרת משאבה פריסטלטית.

מצע ה-nuke view 4 88 יציב בתרבית תאים עבור ניסויים הנמשכים עד 36 שעות. לכן, ניתן לבצע ניסויים לאורך פרק זמן זה. ראשית, הגדירו את המיקרוסקופ להדמיית פלואורסצנציה של חלבון פלואורסצנטי אדום וירוק.

לאחר מכן, לחצו על הערוץ האדום כדי להציג את התאים שעברו טרנספקציה. בחרו ושמרו כ-12 פריימים שבהם מופיעים מספר תאים שעברו טרנספקציה, ושמרו את נקודות אלו של שלב ה-XY. הגדירו למיקרוסקופ לצלם תמונות בערוץ השדה המואר (brightfield), בערוץ האדום ובערוץ הירוק בנקודות השלב השמורות הללו מדי שש דקות.

לאחר איסוף מספר נקודות XY מניסויים כפולים או משולשים, רכז את הנתונים מניסויים נפרדים שבוצעו בימים שונים ובצע ניתוח נתונים ובדיקה סטטיסטית כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב, כדי להשוות את היחס בין תאים שליליים ל-CASP bay לבין תאים חיוביים ל-CASP bay. תסבסריט Nuke view 4 88 יכול להעיד על קצב אפופטוזיס מוגבר בתרביות תאי גליה N 19 oligo DDR. תמונות בסיס אלו נרכשו באמצעות עדשה פי 10, לאחר טיפול בריכוז גבוה של אשלגן חוץ-תאי.

תאי N 19 עברו טרנספקציה של RFP וטופלו ב-3 µL של substrate NukeView 488 עבור תאי הביקורת, או ב-3 µL של substrate NukeView 488 ו-80 mM אשלגן. תמונות אלו ממחישות כי מספר התאים האפופטוטיים עולה עם הזמן, 3, 6 ו-9 שעות לאחר טיפול ב-80 mM אשלגן; בתנאי ביקורת, לא נצפו כמויות משמעותיות של אפופטוזיס בהשוואה לתרביות שטופלו ב-80 mM אשלגן. אות הרקע הירוק שנצפה בתנאי הביקורת מעיד על תאים שעוברים אפופטוזיס ללא הוספה של אשלגן חוץ-תאי.

מהלך זמן של 12 שעות מספיק למחקרים הכוללים פגיעות נוירולוגיות. לאחר 12 שעות, תרביות שטופלו באשלגן הראו מוות תאי של כ-45%. כמעט אף אחד מהתאים בניסוי הביקורת אינו מראה אפופטוזיס בנקודת הזמן של 12 שעות. עם זאת, במצבים אחרים, ייתכן שיהיה צורך להריץ את הניסויים למשך זמן רב יותר.

גרף זה מראה את העלייה במספר התאים החיוביים ל-caspase three לאורך מהלך הניסוי שנמשך 12 שעות. לאחר התאמה, ניתן לבצע טכניקה זו בשעה אחת ולאסוף נתונים במהלך הלילה אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על עקביות בין הטיפולים השונים בעקבות ביצוע הפרוצדורה.

ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון צביעה אימונוהיסטוכימית, כדי לבחון חלבונים תחתונים אחרים המעורבים במסלולים שנלמדו. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה של אופן הכנת הדגימות לדימוי. רכשו סט נתונים ונתחו את הנתונים שלכם.