Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכיר לסטודנטים למדעים לתואר ראשון את טכנולוגיית המיקרו-מערכים (microarray) באמצעות בחינת הבדלי הביטוי בשמרים תחת עקה חמצונית. הדבר משיג תחילה על ידי בידוד RNA כולל מתרביות שמרים שעובדו עם מי חמצן ומהביקרים שלא עובדו. השלב השני של הפרוצדורה הוא הפקה וניקוי של cDNA מדגימות RNA אלו.

לאחר מכן משתמשים ב-CDNA כדי להכין CRNA המסומן בביוטין באמצעות תמלול in vitro. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא פרגמנטציה של ה-CRNAs המסומנים בביוטין לצורך היברידיזציה לשבבי גנים של שמרים מבית AFI metrics. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את הבדלי הביטוי בשתי דגימות השמרים, ומאמצעות ביו-אינפורמטיקה להדגים לסטודנטים לתואר ראשון את העוצמה של אנליזת מערכים של מיקרו-שבבים (microarray).

צוות ההסברה של רשת הגנטיקה של ורמונט (Vermont Genetics Network Outreach) הגה לראשונה את הרעיון לשיטה זו כאשר הוטלה עליו המשימה להנגיש טכנולוגיית מיקרומערכים (microray) לסטודנטים למדעים ברחבי מדינת ורמונט, במטרה לשפר את השכלתם המדעית. עד כה, שיטה זו הועברה למספר אתרים בשמונה מכללות לתואר ראשון ברחבי המדינה. לפיכך, היתרון המרכזי בשימוש במערכי לימוד של מיקרומערכים הוא היכולת להנחית קבוצה של אנשים בטכניקות כלליות של ביולוגיה מולקולרית הנמצאות בשימוש יומיומי במעבדה.

בנוסף, אנו משתמשים בכך כדי להורות לסטודנטים ולמורים כאחד, וכן לקבוצות שלנו. בפועל, יש לנו סטודנטים ופרופסורים העובדים יחד על אותו פרויקט. הם לומדים טכניקות מסוימות הדורשות מיומנות גבוהה, כגון טיפול ב-RNA, שאינו משימה פשוטה.

הם לומדים כיצד להשקיע DNA באמצעות ריאגנטים לוויזואליזציה. הם מקבלים הזדמנות להשתמש בטכניקות אותן הם יפגשו בלימודי תואר שני או במעבדות מולקולריות יומיומיות. אף ששיטה זו מתאימה להשגת תובנות על עקה חמצונית ושמרים, היא בהחלט ישימה עבור אורגניזמי מודל אחרים ומערכות ביולוגיות אחרות שתרצו לבחון.

שינויים בביטוי גנים מתרחשים בין אם הם קשורים לשינויים התפתחותיים, רעלנים סביבתיים, מצבים מחלתיים ספציפיים, וגורמים רבים נוספים. כדי לבחון את הבדלי הביטוי בשמרים הנחשפים לעקה חמצונית, תחילה מופק RNA כולל משני תרביות שמרים באמצעות ליזיס אנזימטי. תרבית אחת נחשפה לעקה חמצונית על ידי טיפול של שעה אחת ב-0.5 millimolar מימן פרוקסיד ב-hank's buffered saline, בעוד שהתרבית השנייה טופלה ב-HBSS בלבד כביקורת.

התחילו בסימון של שתי מבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 1.7 milliliter במידע הזיהוי המתאים. העבירו 1.5 milliliters של תרבית השמרים המתאימה לכל מבחנה. סבבו את המבחנות בצנטריפוגה ב-5,000 Gs למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הצנטריפוגציה, השתמש במיקרו-פיפט כדי להסיר בזהירות ולשפוך את הנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע למשקע (pellet). ודא שהמשקע גדול מספיק לפני המשך הפרוצדורה. אם המשקע קטן מדי, הוסף 1.5 milliliters של תרבית לאותה מבחנה המכילה את המשקע, ולאחר מכן בצע צנטריפוגציה כדי לקבל משקע גדול יותר.

שאי את הנוזל העליון באמצעות מיקרופיפטה, והסר כמה שיותר מהנוזל מעל משקע השמרים. לאחר מכן, הוסף למשקע השמרים 100 µL של SG buffer ו-30 µL של תמיסת liase וערבב באמצעות וורטקס. דגרי את שני המבחנות למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר במהלך הדגירה.

סובבו בעדינות כל מבחנה בכל 10 דקות כדי ליצור ספרו-פלסטים. אחד השלבים הקריטיים ביותר בעת ביצוע פילוט של שמרים בשיטת הספרו-פלסטים הוא לוודא שבאמת נוצרו ספרו-פלסטים בשיעור של מאה אחוזים לאחר הטיפול. המשמעות היא שלא כל האנזימים הליטיים הם שווים.

לפיכך, עליכם לוודא שהאנזים הליטי האיכותי מספק תוצאות טובות של plating לספרואידים, כלומר עליכם לקחת את הדגימות הללו, להניחן על זכוכית מיקרוסקופ ולבדוק אותן תחת המיקרוסקופ על ידי הוספה של 0.1%SDS כדי להבטיח שנוצרו פרוטופלסטים. כדי לתצפת על plating מלא של ספרואידים, טפטפו 10 µL מדגימת השמרים על זכוכית מיקרוסקופ ובחנו את הדגימה תחת המיקרוסקופ עם 1 µL של 0.1%SDS כדי לגרום לתאי השמרים להתנפח ולהפוך לכדורים מושלמים או לספרואידים. חשוב לוודא גם שתאי ניבוב יוצרים ספרואידים.

אם נצפתה שקיעה חלקית של כדוריים (sphero plating), מומלץ לבצע טיפול ממושך יותר עם liase. לאחר שאישור שקיעה מלאה של כדוריים הושג עם 350 microliters של בופר BRLT לכל מבחנה, יש להוסיף 250 microliters של 100% ethanol. ודאו שהמבחנה סגורה היטב על ידי החזקת המכסה סגור, ובצעו ערבוב חזק ב-vortex למשך דקה אחת.

פרוצדורה זו תשמש לליסיס של פלטות ה-Sphero. לאחר מכן, השתמש בעמודי ספין מסוג R and easy Z כדי לאסוף ולנקות את ה-RNA משתי התרביות. לבסוף, העरक את איכות ה-RNA שהופק באמצעות ג'ל agarose precast בריכוז 1.2% לאלקטרופורזה, כדי להכין CRNA מסומן בביוטין.

ה-RNA הכולל שהופק מתאי השמרים משמש תחילה לסנתזת cDNA באמצעות תעתוק הפוך. לאחר הפקת ה-cDNA, הכינו מבחנות gel phase lock לשימוש בשיקוע cDNA; סובבו את מבחנות ה-gel phase lock בצנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך דקה אחת כדי להבטיח שהג'ל נמצא בתחתית המבחנה. אין לנער במערבל (vortex) את מבחנות ה-phase lock. כדי להשקיע את ה-cDNA, העבירו באמצעות פיפטה 162 µL מהשכבה התחתונה של תערובת tris buffered phenyl chloroform, isoamyl alcohol או PCI ב-pH 8.0, והוסיפו אותם ל-162 µL מהתוכן של מבחנת תגובת סנתזת הגדיל השני של ה-cDNA; בשלב זה נדרשים נפחים שווים של התערובות המימיות והאורגניות.

בצעו ערבוב במכשיר וורטקס למשך חמש שניות כדי לערבב את התוכן. לאחר מכן, השתמשו במיקרופיפטה כדי להעביר את כל תערובת ה-CD N-A-P-C-I לשפופרת ה-phase lock gel. אין להשתמש בוורטקס בשפופרת ה-phase lock gel; סובבו בצנטריפוגה במהירות מקסימלית למשך שתי דקות.

לאחר מכן, השתמש במיקרו-פיפט כדי להעביר את השכבה העליונה מתוך מבחנת ה-phase lock gel למבחנה חדשה המסומנת בנפח 1.7 milliliter. נסה לאסוף כמה שיותר מהשכבה. הוסף למבחנת המיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.7 milliliter את הרכיבים הבאים: 405 µL של 100% ethanol, 80 µL של ammonium acetate ומיקרו-ליטר אחד של pellet paint, ולאחר מכן בצע ערבוב ב-vortex.

הניחו את המבחנה ב centri-fuge כאשר הציר של המבחנה פונה החוצה, וסובבו במהירות מקסימלית למשך 20 דקות. בסיום הסבוב בטמפרטורת החדר, הוציאו בזהירות את המבחנה מה-centrifuge תוך הקפדה שלא להפריע למשקע ה-CD NA. המשקע אמור להיות בצבע ורוד בשל צבע הסימון של המשקע, ובגודל של גרגיר מלח בקירוב.

ובצדו של המבחנה, מתחת לציר, הניחו את כדורית ה-CD NA על קרח ועברו מיד לניקוי הכדורית. כדי להתחיל בהליך לניקוי כדורית ה-CD NA, השתמשו במיקרופיפטה P 1000 כדי להסיר בזהירות את כל הנוזל העליון (supernatant) מהמבחנה. היזהרו לא להפריע לכדורית.

הוסיפו למדגם שלכם 500 µL של 80% ethanol קר לתוך הפרונטה. סגרו את הפרונטה בעדינות והפכו אותה לאט מספר פעמים. עקבו מקרוב אחר המשקע כדי לוודא שהוא אינו נפרד מדופן הפרונטה.

אם המשקע הופרד, ניתן להחזירו לתחתית הפ ;השפרופה על ידי החזרת השפרופה למעמד והמתנה עד שהמשקע ישקע לתחתית, או על ידי צנטריפוגה של השפרוורה במהירות מלאה למשך 15 שניות. לאחר מכן, השתמש במיקרופיפט P 1000 כדי להסיר בזהירות את האתנול מבלי להפריע למשקע. הטה את השפרופה כדי לאפשר הסרה של כמה שיותר נוזל.

הוסיפו נפח חדש של 80% ethanol קר, סגרו את המבחנה במכסה והפכו אותה באיטיות מספר פעמים. לאחר מכן, הסירו ככל האפשר את כל ה-ethanol באמצעות מיקרופיפט P 1000. סבבו את המבחנה בצנטריפוגה במהירות מרבית למשך חמש שניות.

לאחר מכן, השתמש במיקרופיפטה P 10 כדי להסיר את המיקרוליטרים האחרונים של אתנול מבלי להפריע למשקע. הנח את המבחנה הפתוחה בתיבת ייבוש למשך 10 עד 20 דקות כדי לאדות את האתנול שנותר. קל לאבד את המשקע לאחר שהתייבש, לכן יש להקפיד לטפל במבחנה בעדינות ולסגור את הפקק.

בסיום הייבוש, בדקו ויזואלית את המשקע המיובש כדי לוודא כי הוא נמצא במבחנה. לבסוף, השביחו שוב את המשקע המיובש ב-22 µL של RNA free water והניחו את המבחנה על קרח. ה-CDNA זה משמש לאחר מכן להכנת CRNA מסומן בביוטין באמצעות שעתוק in vitro בעזרת ערכת Enzo BioArray.

לאחר שה-cRNA המסומן בביוטין נוקה ונמדד, הוא עובר פרגמנטציה לצורך הכנת המטרה. ברגע שה-cDNA נוצר, אנו משתמשים בשיטת שעתוק in vitro סטנדרטית כדי להפיק cRNA ביוטינילי. ה-cRNA חייב לעבור פרגמנטציה לפני שניתן להחיל אותו על שבב המיקרו-מערך.

כדי להתחיל בהליך זה, העבירו כמות שווה ל-5 µg של CRNA לשפופרת PCR של 0.5 mL מסומנת. הוסיפו מספיק מים נקיים מ-RNases כדי להביא את הנפח הכולל ל-16 µL, ולאחר מכן הוסיפו לשפופרת 4 µL של fragmentation buffer בריכוז 5x. הנפח הכולל בשפופרת צריך להיות 20 µL.

ערבבו את המבחנה בוורטקס וסובבו אותה בצנטריפוגה למשך 10 שניות. לאחר מכן, דגרו את המבחנה בטמפרטורה של 94 °C למשך 30 דקות. במכשיר תרמוסייקלר, הניחו את המבחנה על קרח עם סיום הדגירה.

לאחר מכן, ה-CRNA המקטע והבלתי-מקטע מכל דגימה נבחנים באמצעות אלקטרופורזה בגל AROS מוכן בריכוז של 1.2%. עם סיום ההרצה, הג'ל מוצג על גבי טרנסלומינטור ותמונה נלכדת. תוצר הסינתזה הסופי עובר היברידיזציה לשבבי גנים של שמרים מסוג atric, ותוצאות מייצגות מניתוח המיקרו-מערך מוצגות כאן.

איור ראשון זה הוא דוגמה לתמונה סרוקה של שבב גנים של שמרים מבית atrics, שהופקה על ידי תוכנת ההפעלה של שבב הגנים של atrics. זהו תרשים פיזור דו-ממדי של כל התעתוקים הגנטיים, כ-6,700 גנים, המשווה בין נתוני שמרים של קבוצת ביקורת לקבוצת טיפול. כל נקודה מייצגת גן בודד.

גנים הצבועים בסגול מצביעים על גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי, בעוד שגנים הצבועים באדום אינם כאלה. בדוגמה זו, מרבית הגנים בעלי הביטוי הדיפרנציאלי הם אלה המעורבים בבקרת מחזור התא, כפי שעולה מתיאוריהם. תרשים זרימה זה, מתוך מאגר המידע להדמיית אנוטציה וגילוי אינטגרטיבי, ממחיש גנים בעלי ביטוי דיפרנציאלי במסלול ביולוגי פגוע.

הגנים המסומנים בכוכבית אדומה מצביעים על הגנים בעלי ביטוי מופחת (downregulated) במסלול המיוטי. לבסוף, מוצגות כאן תוצאות מייצגות של תרשים געש (volcano plot) שהופק באמצעות תוכנת geo species gene sifter. דגימות הבקרה והדגימות המטופלות הושוו עם ערך סף של P-value של 0.05 וערך סף של שינוי בביטוי של 1.5 fold.

בחרנו להשתמש בשמרים כיוון שקל לגדלם במהירות, אך הבנו כי החלק הקריטי ביותר בעבודה עם שמרים הוא למעשה יצירת פלטי ספרופלאסטים (sphero plating) תקינים. אחד הדברים שאנו מעוניינים למנוע בניסויי מיקרו-מערך (microarray) הוא עיכול חלקי, שיוביל לכך שרק תאי ספרופלאסט הנמצאים בשלב G1 או בשלב G2/M יעברו פלטינג. במצב כזה, ניסוי המיקרו-מערך יבוצע על שמרים הנמצאים בשלב שכפול מסוים.

נקודה מסובכת נוספת שאנו מנסים להבהיר בתרגיל זה היא שהשקיעה של DNA היא נושא שבו מדברים מדי יום, אך היא לאו דווקא פשוטה לביצוע. במודול שלנו השתמשנו למעשה במבחנות ייעודיות ובחומרי ויזואליזציה. כך אנו יכולים לסובב את ה-DNA למטה ולהנחית את השקיעה באופן נראה, מה שמקל על התלמידים והמורים כאחד.

כך שניתן להשתמש בו בכל השלבים של עבודת DNA ו-RNA לאחר פיתוחו. מודול זה סלל את הדרך עבור סגל במוסדות לתואר ראשון לחקור, אולי תוך בחינת אורגניזמי מודל אחרים או משטרי טיפול אחרים שעשויים להתאים לתכניות הלימוד הקיימות או אולי למסגרת תחומי המחקר האישיים שלהם. כדי לתת לכם דוגמה לחלק מהשינויים שבוצעו, היה אתר אחד שבחן את השפעות הטיפול בהרביציד על שמרים, אתר אחר שבחן טיפול ב-LAMP IDE בשמרים, בעוד שאתר שלישי בחן שינויים התפתחותיים בקו תאים של יונקים שמעניין אותם במיוחד.

ולסיום, אתר אחר בחן את ההשפעה של מקורות אור דיפרנציאליים על צמחי arabidopsis. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן הקמתו של ניסוי microray עם סטודנטים למדעי המדעים לתואר ראשון, כולל בידוד RNA כולל משמרים, הפקת cDNA ופרגמנטציה של cRNA מסומן בביוטין. חוויות מעשיות עם טכנולוגיות ברמה גבוהה זו מסייעות בחיזוק וביסוס ההשכלה המדעית בתואר הראשון.