קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור פרופילים של ביטוי גנים העומדים בבסיס פנוטיפים רבים או מסלולים מטבוליים. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד mRNA משני זני נמטודה מנוגדים. השלב השני של הפרוצדורה הוא סינתזה של cDNA המכיל רצפי לכידה של S SI three או SFI, והיברידיזציה שלהם למערך מיקרו (microarray).

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא ביצוע היברידיזציה למערך המיקרו (microarray) עם רצפי לכידה אנטי-ספציפיים המכילים S SI three ו-SCIFI fluoro fours. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא סריקת מערך המיקרו וניתוח הנתונים באמצעות כלים ביואינפורמטיים כגון תוכנת magic tool. בסופו של דבר, מזוהים הגנים המועמדים המתווכים את התופעה הביולוגית הנבדקת, וניתן לתקף ולכמת אותם בטכניקות חלופיות כגון real-time PCR.

בדרך כלל, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה כיוון שהנוקלאוטידים המודפסים אינם נראים למשתמש, ולכן קשה להניח תערובת היברידיזציה הומוגנית מעל למעל 23,000 הנוקלאוטידים המודפסים באופן ייחודי. התחילו באיסוף RNA מנמטודות בריאות ומסונכרנות. ראשית, שוטפים אותן, מרחיפים אותן באנבונות של 15 milliliter ומצמידים אותן לצנטריפוגה; את כדוריות התולעים המצמידות מרחיפים ב-7 milliliters של 0.1 molar sodium chloride וב-7 milliliters של sucrose בריכוז 60% weight per volume קר במקרר.

לאחר דגירה של 15 דקות על קרח, התולעים מרוכזות שוב למשקע. כעת, תולעים נקיות מחיידקים ישחו כלפי מעלה; אלו נאספות, נשטפות במים נקיים מ-RNA ומרוכזות למשקע. שוב, המשקע הנקי והדחוס באופן רופף מועבר למבחנה למיקרו-צנטריפוגה וסובב במהירות מקסימלית למשך 30 שניות.

יש לשאוב ולאחסן ב-10 נפחים של RNA later בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד למועד המשך התהליך. להכנת דגימות RNA כולל, יש לסבב במרכזפוגה את המשקעים שהוכנו במהירות מקסימלית, להסיר את הנוזל העליון ולהוסיף קמצוץ של שרף טחינה מולקולרי למשקע. לאחר מכן, יש להקפיא את התערובת באמצעות חנקן נוזלי תוך שימוש בעלי.

טחנו את תרחיף התולעים הקפוא לאבקה דקה, והוסיפו חנקן נוזלי לפי הצורך כדי לשמור על קור האבקה לאחר הטחינה. הניחו את התמצית על קרח למשך חמש דקות. לאחר חמש דקות, ערבבו את התמצית עם 700 µL של R-L-T-B-M-E ו-472 µL של ethanol 100% בסך הכל.

כעת ניתן לבודד RNA באמצעות ערכה זמינה מסחרית לנפח סופי של 60 microliters של RNA מבודד לכל דגימה ביולוגית. לפני ההמשך, יש להסיר זיהום פוטנציאלי של DNA גנומי על ידי טיפול ב-DNase I, ולאחריו שימוש בערכה זמינה מסחרית לניקוי RNA. השלם את תהליך השימוש בערכה תוך התייחסות לנפח של 60 microliter.

לבסוף, קבעו את ריכוז ה-RNA והעריכו את שלמות ה-RNA באמצעות טיפול ב-glyoxal, טעינה של דגימה, צבע ואנליזת ג'ל לפני ההכלה (hybridization) של המיקרו-מערך (microarray). באמצעות שיטות קונבנציונליות, ה-RNA המטוהר עובר תעתוק הפוך ל-DNA משלים (complementary DNA), אשר מטוהר מהתבנית המוכלת באמצעות ערכה זמינה מסחרית ומובא לנפח של 60 µL. התחילו את ההכלה של המיקרו-מערך על ידי חסימה של שקופיות מיקרו-מערך בעזרת DNA של זרע סלמון שעבר סוניקציה. לאחר שעה, טבלו את השקופיות החסומות במים מזוקקים פעמיים וסובבו אותן.

ייבשו את השקופיות במבחנות קוניות של 50 milliliter המרופדות ב-kim wipe. כעת הכינו תמיפת היברידיזציה מבוססת פורממיד בריכוז two x. ראשית, חממו אותה ל-55 degrees Celsius למשך 10 דקות כדי להמיס לחלוטין את הגבישים.

לאחר מכן, סבבו במסנטרטגה למשך דקה אחת במהירות של 10,000 gs. בשלב הבא, ערבבו 25 µL של CD NA עם 25 µL של תמיסת היברידיזציה (hybridization buffer), ונערה את התערובת בעדינות. כעת, בצעו סבב קצר (quick spin) לתערובת והדגירו אותה בטמפרטורה של 80 °C למשך 10 דקות.

לאחר הדגירה, העבירו בזהירות בעזרת פיפט את כל דגימת ה-CDNA למשטח המיקרו-מערך (microarray slide) ללא מגע עם המשטח, כדי לפרוס את הדגימה באופן אחיד על פניו. הניחו בעדינות זכוכית כיסוי על המשטח באמצעות מחט של מזרק; לפני שהזכוכית יורדת לחלוטין, הרימו אותה חזרה והורידו אותה שוב בעזרת המחט, כדי לאפשר לזכוכית הכיסוי לנחות בעדינות במקומה.

טכניקה זו ממזערת את היווצרותן של בועות אוויר. כעת הניחו את הזכוכית באופן אופקי בתוך מבחנה קונית של 50 milliliter, הוסיפו מתחת לזכוכית 50 microliters של מים מזוקקים פעמיים והניחו לה להדגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. למחרת, תבוצע היברידיזציה שנייה זמן קצר לאחר שטיפת הזכוכית.

במספר שלבים בתהליך ה-SSC, מיושם הבאפר השני, המכיל ריאגנטים ללכידה הרגישים לאור וריאגנט Antifa, תוך שימוש באותה טכניקה, ולאחריו דגירה קצרה, שטיפות נוספות וייבוש. לאחר מכן ניתן לסרוק את השקופית. ניתן לנתח את התמונות באמצעות תוכנה חינמית בעלת כלי קסם בקוד פתוח.

בתוך לשונית הפרויקט (project), צרו ושמרו פרויקט חדש תחת לשונית בניית פרופיל ביטוי (build expression profile), בחרו בטעינת זוג תמונות (load image pair) ובחרו את קובץ התמונה האדומה כצבע אדום ואת קובץ התמונה הירוקה כצבע ירוק. לאחר מכן, בחרו בלשונית בניית פרופיל ביטוי (build expression profile). בחרו בטעינת רשימת גנים (load gene list) כדי להעלות קובץ רשימת גנים של C elegance שהושג מאתר GCAT, לצורך מיפוי וסידור תמונת המערך המיקרוסקופי (microarray image).

בחר בלשונית build expression profile ובאפשרות create edit grid. כעת ערוך את הגריד. הגדר את תיבת הדיאלוג באמצעות 48 עבור מספר הגרידים, 22 שורות ו-22 עמודות עבור כל גריד, ובחר במספור נקודות משמאל לימין ומלמעלה למטה.

הגבירו את אחוז שינוי הניגודיות (contrast change) ובצעו זום-אין על הגריד עד שהנקודות הבודדות יהיו ניתנות להבחנה בקלות. צרו את הגרידים על ידי בחירה בנקודה השמאלית-עליונה (set top left spot) בפאנל השמאלי, ואז לחיצה על מרכז הנקודה השמאלית-עליונה, לאחר מכן על הנקודה הימנית-עליונה ועל השורה התחתונה בגריד הראשון. חזרו על הליך הגריד עבור כל אחד מ-48 הגרידים, תוך התקדמות משמאל לימין ומלמעלה למטה.

לאחר מכן, שמרו את התוצאות על ידי בחירה בלשונית הקובץ (file) ובחירה ב-"save current grid as" לאחר השמירה. בחרו בלשונית ה-finished כדי להסיר נקודות שאינן רלוונטיות מהניתוח. פתחו את לשונית "build expression profile" ותחת אפשרות ה-addressing gridding, בחרו ב-spot flagging.

כעת סמנו כל כתמי מריחה או פלואורסצנציית רקע ושמרו על ידי בחירה ב-save current flags. תחת לשונית file, יש לבצע סגמנטציה לקבצים שסומנו. לבסוף, נתחו גנים שהודעו או דוכאו על ידי גורם מסוים על ידי בחירה ב-explore תחת לשונית expression.

בתיבת הדיאלוג של החיפוש (exploring), הגדירו את קריטריוני ההתאמה לגנים המעודנים. מספר העליות או הירידות הפי שתיים בביטוי. העוצמה נקראת x וערכו של X הוא הקריטריון לשינוי בביטוי.

X מוזן תחת ערך מקסימלי הגבוה מ-X עבור גנים מושרים וערך מינימלי הנמוך מ-x עבור גנים מדכאים. בניסוי זה, מבוצע בקרת החלפת צבע (dye swap control); שני בידודים עצמאיים של RNA כולל מזחלי שלב שלוש ושלב ארבע עוברים היברידיזציה כמעטנט ירוק לעומת פראי אדום, בעוד שמעטנט אדום לעומת פראי ירוק משמשים לאישור שינויים בביטוי הגנים. בצעו שלושה בידודים עצמאיים של RNA כולל באמצעות אותו הליך, סנתזו cDNA באמצעות ערכה זמינה מסחרית, ועבור כל דגימת cDNA בצעו real-time PCR בשלישייה תוך שימוש בשלושה גני בית (housekeeping genes) כביקורות. להדגמה, התוצאות הבאות בוחנות ביטוי גנים שהושר ב-VSM one.

מוטנטים AK 1468 הם זן של נמטודה המאופיין בסינפסה מוגברת; לפני ביצוע ניתוח מיקרו-מערך (microarray), נבדקת איכות ה-RNA שהופק באמצעות אלקטרופורזה בג'ל. נוכחותן של שתי תתי-יחידות ריבוזומליות שלמות לפני ואחרי טיפול ב-dase one מעידה על דגימת RNA תקינה במיקרו-מערך; ה-CDNA של סוג הבר (wild type) מסומן באדום וה-CDNA של מוטנט VSM one מסומן בירוק. באחד מ-48 הרשתות המנותחות לכל מיקרו-מערך, כל ריבוע קטן מייצג אוליגו-נוקלאוטיד בודד שהודפס; בכל מערך מיוצג כל אוליגו-נוקלאוטיד ייחודי.

לאחר שניתוח מיקרו-מערך (microarray) של תמלילים שבודדו מזחלים בשלב ארבע הראה כי גנים המקודדים לחלבוני זרע עיקריים, או MSP, מונחים במוטנטים של VSM one, ניתוח מיקרו-מערך של זחלים בשלב שלוש חשף גם הוא שינויים בביטוי בתוך אותה משפחת גנים במוטנט. בדיקת התחזיות מהמיקרו-מערך באמצעות ניתוח realtime PCR גילתה כי חבר אחד ממשפחת הגנים M ms P, שמו MS P 32, מונחה במוטנטים של VSM one. הנתונים מייצגים ממוצע של שלושה חזרות של real-time PCR מאותו אוסף RNA.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה באופן השימוש בכלים ביואינפורמטיים לניתוח גנומי רחב, במיוחד לאור העובדה שתוכנות ביואינפורמטיקה רבות ובקוד פתוח זמינות עבור הקהילה המדעית.