אלומת יונים ממוקדת כרסום מיקרוסקופיית אלקטרונים של רקמת המוח
6 ביולי 2011
פרוטוקול זה מתאר כיצד מוטבע שרף רקמת המוח יכול להיות מוכן צילמו בשלושת המימדים אלומת יונים ממוקדת, סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים.
מטרת פרוצדורה זו היא לאסוף סדרת תמונות מאזור ספציפי של רקמת מוח באמצעות קרן יונים ממוקדת (focused ion beam) ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק. פעולה זו מתבצעת תחילה על ידי חיתוך המוח לפרוסות העוברות צביעה ולאחר מכן השקה בשרף. השלב השני הוא חיתוך אזור העניין מהפרוסה המושהית בשרף והרכבתו על גבי בלוק שרף ריק.
השלב השלישי הוא קיצוץ של בלוק השרף באמצעות אולטרה-מיקרוטום ושימוש בקרן היונים של המיקרוסקופ כדי לבודד רק את האזור המיועד לדימוי. השלב הסופי הוא ביצוע דימוי סדרתי של פני השטח של בלוק השרף, תוך שימוש בקרן היונים להסרה חוזרת של שכבות דקות לפני כל צילום. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המציגות תמונות סדרתיות דרך אזור העניין.
סדרת התמונות נאספת באופן אוטומטי ומערך הנתונים כולל בדרך כלל ווקסלים איזוטרופיים, כך שניתן לצפות במבני התמונה מכל זווית בערימה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופיה אלקטרונית בשידור של חתכים סדרתיים הוא היכולת להשיג רזולוציית Z גבוהה בהרבה. ובהשוון לטומוגרפיה אלקטרונית, היא מסוגלת לדגם נפחים גדולים בהרבה ברזולוציה אופטימלית עבור דגימות המושרות בשרף.
הפרוצדורה מתחילה בהוצאת המוח המקובע מחולדה שהורדמה ועברה פרפוזיה. טמנו את המוח ב-5% aros חמים בתוך תבנית פלסטיק, כוונו את המוח לזווית הנכונה לפני שה-aros התקשה, והצמידו את בלוק ה-aros עם המוח בתוכו למחזיק דגימות באמצעות vibrato slice. בצעו חיתוכים קורונליים בעובי 80 micron, וחתכו מספר חתכים ככל שנדרש כדי לכלול את אזור העניין.
לאחר מכן, העבירו את הדגימות למבחנות בידוד מזכוכית בנפח 20 milliliter. הניחו עד 10 חתכים בכל מבחנה. שטפו את הדגימות שלוש פעמים למשך חמש דקות בכל פעם בבופר K coate בריכוז 0.1 molar.
לאחר מכן, צבע את הדגימות ב-1.5% potassium cyanide ו-1% osmium tetroxide בבופר K coate בריכוז 0.1 molar למשך 30 דקות. המשך בצביעת הדגימות ב-1% osmium Tetroxide בבופר K coate בריכוז 0.1 molar למשך 30 דקות. לאחר מכן, שטוף פעם אחת במים מזוקקים פעמיים למשך שלוש דקות, ולאחר מכן צבע ב-1% al acetate במים מזוקקים פעמיים למשך 30 דקות.
לאחר מכן, שטפו את החתכים במשך חמש דקות במים מזוקקים פעמיים, ואזבצעו להם דהידרטציה בסדרה מדורגת של אלכוהול, תוך המתנה של שתי דקות לכל החלפה. השלב הבא הוא הטמעת החתכים בריכוזים עולים של שרף Duran המעורב עם אלכוהול, תוך המתנה של 30 דקות בין ההחלפות. התחילו ביחס של 50 ל-50 של אתנול לשרף, לאחר מכן 30 ל-70, לאחר מכן 10 ל-90, ולבסוף העבירו את החתכים ל-100% שרף למשך 30 דקות.
לאחר מכן, החליפו את המדיום ב-100% fresh duran resin. ערבבו באיטיות במשך שעה במיקסר גלגלי. לאחר ההטמעה, השתמשו במקל דереק דק כדי להניח את החתכים על תזרירי מיקרוסקופ מזכוכית שצופו מראש בחומרי הפרדה מהתבנית.
הניחו כמה שיותר חתכים על הזכוכיות, אך הקפידו לא להעמיס עליהן יתר על המידה. ודאו שמוצמדת גם תווית זיהוי בין זכוכיות המיקרוסקופ. הכניסו את הזכוכיות לתנור בטמפרטורה של 65 degree Celsius למשך 24 שעות.
ביום למחרת, הוציאו את הדגימות מהתנור. דחפו בעדינות להב תער בין זכוכיות המיקרוסקופ והסירו את שכבת השרף המכילה את הדגימות מבין הזכוכיות, תוך החזקת שכבת השרף באצבעותיכם. שטפו בעדינות את הדגימה תחת זרימת מים.
כדי להסיר חומרי הפרדה מהתבנית, הנח את הדגימה תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי עם תאורה חודרת תוך שימוש בעדישה בעלת הגדלה נמוכה. סמן את אזור העניין באמצעות מחט דקה. השתמש בלהב תער כדי לחתוך ריבוע קטן של 3 מילימטר על 3 מילימטר סביב אזור העניין.
השתמשו בדבק אקרילי כדי להצמיד את בלוק הרזין הקטן לחלקו העליון של בלוק רזין ריק. לאחר מכן, הדקו את הבלוק במחזיק של המיקרוטום האולטרה (ultra microtome). התבוננו דרך מיקרוסקופ הסטריאו המחובר, והשתמשו בלהב תער כדי לגזום את האזור מסביב לאזור העניין עד שיישאר רק פירמידה קטנה של חומר.
חתכו את קצה הבלוק קרוב לאזור העניין בזווית למשטח העליון של הבלוק באמצעות סכין זכוכית מקובעת לאולטרה-מיקרוטום. טרמו את הבלוק עוד יותר כך שניתן יהיה למקם את אזור העניין במדויק ביחס לממדי משטח הבלוק. הוציאו את הבלוק מהאולטרה-מיקרוטום והניחו אותו תחת מיקרוסקופ אור חודר.
צלמו את אזור העניין. השתמשו במסור תכשיטנים כדי לחתוך את הבלוק המקוצץ מהבסיס שנותר של השרף באמצעות צבע פחמן. הדביקו את הבלוק המופרד על מחזיק דגימות ל-SEM וכוונו אותו כך שהצד המיועד לדימוי יפנה אל הקצה החיצוני ביותר.
לאחר שהדבק התייבש, העבירו את הדגימה למערכת של וקואקום-אוואפורציה (vacuum evaporation) וצפו את הבלוק בשכבה דקה של זהב בעובי של יותר מ-20 nanometers. בלוק הרקמה הטמיע בשרף מוכן כעת לדימוי במיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם אלומת יונים ממוקדת (focused ion beam scanning electron microscope). הכניסו את הדגימה בתוך התושבת שלה למיקרוסקופ בהגדלה נמוכה, ובאמצעות דימוי אלקטרונים משניים, כווןו את הבלוק כך שהאזור המבוקש והצד של הבלוק המיועד לדימוי יהיו פונים כלפי מעלה.
המפעיל מכוון את הבלוק כך שהפנים שיוצג בדמיון יהיה מקבילי לקרן הכרסום. כתוצאה מכך, קרן האלקטרונים תכוון בזווית של 54 מעלות לפנים זה, תוך שימוש בזרם קרן יונים של 13 עד 27 nano amps, במתח של 30 kilovolts.
הסר פס צר של שרף מהחלק הקדמי של האזור המיועד לדימות. לאחר מכן, עבור למצב דימות של פליטה אחורית (back scattered imaging) כדי לצפות בפני השטח שנשחרו מעל אזור העניין. באמצעות תמונת הייחוס מהמיקרוסקופ האורי כך ותמונת הפנים שנשחרו, אתר את האזור המדויק בבלוק שישוחח וידומת באמצעות מערכת הזרקת הגז של המיקרוסקופ.
השקיעו שכבת הגנה בעובי של מיקרון אחד של פחמן או מתכת על פני השטח של הבלוק מעל אזור העניין, תוך שימוש בזרם של 700 picoamps. לבסוף, בצעו כרסום (milling) לאזור בבלוק שבו יצולמו התמונות הסופיות. אפשרו לקרן הכרסום לכרסם לחלוטין את פני התמונה עד שלא ניתן יהיה לראות שרידי כרסום (milling artifacts) על פני השטח.
בחרו את פרמטרי המיקרוסקופ לצילום סדרתי של הפנים. פרמטרים טיפוסיים הם מתחים בין 1.2 ל-2 kV עם גודל פיקסל שבין 4 ל-20 nm. זמן השהיית הפיקסל צריך להיות בסביבות 10 µs, כך שהזמן הכולל לשיוף הפנים ולהשגת תמונה אחת יהיה פחות משתי דקות.
השאירו את המיקרוסקופ למנוחה למשך שעתיים לפחות כדי לאפשר התייצבות של שינויים תרמיים. כדי לפזרם, התחילו בתהליך הכרסום והדימוי לצורך רכישת סדרת תמונות דרך אזור העניין. איור זה מציג תמונת פיזור לאחור (back scattered) בניגודיות הפוכה של פני הבלוק, המראה את העל-מבנה בתוך אזור במוח העטוף.
כל הממברנות נראות, כמו כן מבנים מקרו-מולקולריים גדולים. איור זה מורכב מסך של 1,600 תמונות שנאספו במרווחים של חמישה ננומטרים, מה שיוצר ערימת תמונות עם ווקסלים איזוטרופיים. ניתן לדגם ערימה זו בכל מישור באותה רזולוציה.
לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן הכנת רקמת מוח לצילום סדרתי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם אלומה ממוקדת (FIB-SEM).
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר את ההכנה והדימות של רקמת מוח מוטמעת בשרף בתלת-ממד באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בעל אלומת יונים ממוקדת. שיטה זו מאפשרת דימות ברזולוציה גבוהה של אזורי מוח ספציפיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- טכניקות דימות
- היסטולוגיה
רקע
- מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת עם קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM) מציעה יתרונות על פני שיטות דימוי מסורתיות.
- היא מספקת רזולוציית Z גבוהה יותר ויכולת לדמיין נפחים גדולים יותר של דגימות הטמעות בשרף.
- טכניקה זו שימושית במיוחד לחקר ארכיטקטורת רקמת המוח.
- דימוי סדרתי מאפשר ניתוח מקיף של אזור העניין.
מטרת המחקר
- לאסוף סדרות של תמונות מרקמת מוח לצורך ניתוח מבני מפורט.
- להדגים שיטה המשפרת את רזולוציית הדימוי ואת היכולת לסרוק נפחים.
- להקל על חקר אזורי מוח ספציפיים בהקשר תלת-ממדי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דיסקציה והטמעה של רקמת מוח בשרף.
- חיתוך סדרתי וצביעה של פרוסות מוח.
- קיצוץ והרכבה של בלוק השרף לצורך דימות.
- דימות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בעל אלומת יונים ממוקדת (FIB-SEM).
תוצאות עיקריות
- איסוף מוצלח של סדרת תמונות דרך אזור העניין.
- השגת דימות ברזולוציה גבוהה עם ווקסלים איזוטרופיים.
- הוכחת יכולת להדמיות של מבנים מזוויות מרובות.
- התוצאות מראות שיפור משמעותי לעומת שיטות דימות מסורתיות.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה אמינה לדימות של רקמת מוח הטמעה בשרף.
- מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת עם אלומת יונים ממוקדת (FIB-SEM) יעילה למחקרים מבניים מפורטים.
- טכניקה זו יכולה להעמיק את הבנתנו לגבי ארגון רקמת המוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה
מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת עם אלומת יונים ממוקדת (FIB/SEM) מאפשרת דימוי תלת-ממדי ברזולוציה גבוהה של רקמת מוח עם ווקסלים איזוטרופיים קטנים עד כדי 4 nm, ובכך תומכת בניתוח אולטרה-מבני מפורט. יכולת זו משפרת את תיקוף המטרה בתהליכי גילוי תרופות למדעי המוח על ידי אספקת תובנות מכניסטיות לגבי הארכיטקטורה התאית והפתולוגיה. השיטה משפרת את רמת הביטחון החזויה במודלים פרה-קליניים על ידי מתן אפשרות לוויזואליזציה של מבני רקמה מזוויות מרובות ללא ארטיפקטים של חיתוך.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה מפורטת של אולטרה-מבנה התא ומקבצים מקרו-מולקולריים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי חשיפת מטרות מבניות בהקשר הרקמתי הטבעי שלהן.
- ערך ניבוי: משפר את רמת הוודאות לגבי המטרה על ידי מתן אפשרות לניתוח רקמה מכל זווית צפייה בתוך ערימת התמונות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מייצר מערכי נתונים של תמונות סטנדרטיים הניתנים לשחזור ומתאימים לניתוח מורפומטרי כמותי.
- מדרגיות: מאפשר הדמיה של נפחים גדולים יותר מאשר טומוגרפיה אלקטרונית ברזולוציה אופטימלית עבור דגימות המושרות בשרף.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: מייצר ערימות תמונות סדרתיות שניתן לניתוח חוזר עבור יעדים או מסלולים מרובים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שומרת על נאמנות מבנית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות רזולוציית ווקסלים איזוטרופית.
- הפחתת סיכונים מנגנונית: מבהירה קשרי מבנה-תפקוד ברקמת מוח כדי להנחות את בחירת המטרה.
- קידום מותאם סיכונים: תומכת בהחלטות go/no-go על ידי אספקת נתונים מבניים בנאמנות גבוהה על מערכות רלוונטיות למחלה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
FIB/SEM משתלב ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם ועד להדמיה פרה-קלינית, ומאפשר ניתוח מבני המנחה את זיהוי המולקולות המובילות ומחקרי מנגנונים.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים באמצעות ויזואליזציה של מבנים תת-תאיים בנפחי רקמה שלמים.
- סריקה: מספקת מערכי נתונים תלת-ממדיים כמותיים ואיזוטרופיים המאפשרים השוואה מהימנה של פנוטיפים מבניים בין תנאים שונים.
- אנליטיקה: מספקת דימות סדרתי ברזולוציה של סדר גודל ננומטרי, המאפשרת מדידות מורפומטריות מדויקות וניתוח סטטיסטי של ארכיטקטורת הרקמה.
- מחקר תרגומי: מקשרת ממצאים מבניים משלב הגילוי למודלים פרה-קליניים באמצעות דימות עקבי וברזולוציה גבוהה של רקמת מוח.
- שימוש חוזר ארגוני: מכוננת יכולת דימות הניתנת לשימוש חוזר עבור מחקרים אורכיים של מעורבות מטרות טיפוליות ותגובת רקמה.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף המטרה על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במחקרי רקמת מוח.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות וסטנדרטיזציה באמצעות זרימות עבודה אוטומטיות של חיתוך סדרתי והדמיה.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי אפשור הדמיות בנפח גדול ברזולוציה גבוהה, ובכך מפחית את הצורך במספר טכניקות משלימות.
- השפעה על הפורטפוליו: מסייע בתעדוף מותאם סיכונים על ידי אספקת נתונים מבניים מפורטים על מעורבות המטרה ופתולוגיה של הרקמה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהיסטולוגיה, הטמעה בשרף וטכניקות של מיקרוסקופיה אלקטרונית.
- תלוי בגישה למיקרוסקופים אלקטרוניים סורקים בעלי קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM) עם מערכות הזרקת גז וציפוי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים עבור פרוטוקולי הכנת דגימות, צביעה והטמעה.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום השיטה לאזורי מוח שונים או למודלים של מחלות.
- כולל מגבלות מעשיות כגון זמני עיבוד ממושכים והצורך בציפוי מוליך לפני ההדמיה.
