שיטת הדמיה אופטית התואמת למיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת למיפוי מוח תאי מזוסקופי

המחקר שלנו מתמקד בקונקטומיקה. אנו מפתחים שיטות רכישת תמונות אופטיות או אלקטרוניות בעלות תפוקה גבוהה, המאפשרות ניתוח של מעגלים נוירולוגיים ותכונות קישוריות סינפטית כדי לפענח את לוגיקת החיבור הבסיסית של מעגלי עצב. הקונקטומיקה המקורית עם מהפכה גבוהה מוגבלת לנפחי מוח קטנים בשל איסוף נתונים יקר ומדויק, בעוד שניתוח מיקרוסקופי מהיר ומחקר מיקרוסקופי ממוקד מציעים פוטנציאל לקונטומיקה מוחית שלמה.

בהשוואה לגישות מיקרוסקופיות אחרות, כמו מיקרוסקופים שונים של לארנס, OMLIT לוכדת תמונות של כל הנוירונים עם מידע על הדנדריטים והאקסונים. מלבד התאימות שלו למיקרוסקופ אלקטרונים, קיימת הדמיה ברזולוציה ננומטרית נוספת תחת EF. OMLIT מסייע בבניית מודלים ממוחיים מקיפים הממפה את כל ההקרנות לטווח ארוך, כולל כיוון, עוצמתן וטיפוס שלהן, לצד המעגלים המיקרו-מקומיים בשילוב עם נושא סריאלי. הוא מציע תובנות על הארכיטקטורה המובנית וזרימת המידע בכל המוח.

אנו מפתחים הדמיה אוטומטית של OMLIT ורכישת נתוני EM בהנחיית RIs מוגדרים ב-OMLIT, ומאפשרים איסוף וניתוח נתונים קונטומיים יעילים בנפחי מוח גדולים או שלמים. כדי להתחיל, בחרו סרט קפטון או D50 בעובי של 50 מיקרומטר ומותקן על מערכת הסליל הממונעת. באמצעות מערכת התזת מגנטרון עם שני ראשים, מניחים שכבה דקה אחידה של כרום או מתכות אחרות כמו אלומיניום, כסף או נחושת על פני הסרט.

מקם את הסרט במרחק של 80 מילימטרים מהמטרה המתפזרת. בצע את התהליך תחת הספק זרם ישר, ובלחץ של פסקל אחד המוסדר על ידי גז ארגון של 99.99%. כעת, כוון את מהירות סליל הסרט ל-0.6 מילימטרים לשנייה כדי להגיע לעובי ציפוי מתכת של 50 ננומטר.

לאחר ההפקדה, הוציאו את הסרט מהמערכת לאחר שהתקרר לטמפרטורת החדר. הערך את עובי ואחידות הציפוי באמצעות פרופיילר סטיילוס, מיקרוסקופיית כוח אטומי או מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת. לאסטרטגיית רפלקטיביות נמוכה, לנקות ולהפוך את הסרט להידרופילי באמצעות מנקה פלזמה בהספק של 80 וואט תוך תנועת הסרט במהירות של שבעה מילימטרים לשנייה.

לאחר הטיפול, מניחים טיפות מים על פני הסרט כדי לוודא שהן מתפשטות במהירות לשכבה דקה. באמצעות מטחנה קטנה או כלי חיתוך דומה, חתכו בגסות את השרף בצד הדגימה כדי להסיר את השרף הריק שמסביב ולחשוף את אזור הדגימה. הנח את הבלוק המוטמע בשרף במחזיק הדגימה והדק אותו כדי לקבע את הבלוק היטב.

התקן את מחזיק הדגימות על הזרוע הניידת של המיקרוטום. התקן סכין זכוכית או סכין חיתוך יהלום בזווית של 45 מעלות על מחזיק הסכין. מתחת למיקרוסקופ, גזמו את פני הדגימה לצורת פירמידה והחלקו אותו, ואז גזמו והחלקו את ארבעת הצדדים של בלוק הדגימה כדי להסיר עודפי שרף.

סובבו את הכפתור כדי ליישר את הקצוות הקדמיים והאחוריים של הבלוק במצב אופקי. הסר את סכין החיתוך והחלף אותו בסכין יהלום, מונח בזווית של 45 מעלות. קבע את זווית ההטיה של בסיס המיקרוטום לשש מעלות והזיז את מחזיק הסכין באיטיות באמצעות הידית עד שהקצה הקדמי של הסכין נמצא בין מילימטר לשניים מפני השטח של הדגימה.

התבונן ברצועה הבהירה בין משטח הדגימה לקצה הסכין, וכיוון את זווית ההטיה כך שהרצועה תהיה אחידה מלמעלה למטה ומצד לצד. עכשיו, מזריקים מים מזוקקים לחריץ של סכין היהלום כדי להרטיב את הלהב. הסר מעט מים עם מזרק עד שרמת הנוזל יורדת וההשתקפות נראית כסופה.

לאחר מכן, הגדר את עובי החתך, מהירות החיתוך וחלון החיתוך ביחידת הבקרה. כוונו את מהירות החתך ל-0.6 מילימטרים לשנייה ואת עובי החתך ל-60 ננומטר, בהתאם לאיכות הדגימה. התחילו לחתוך עם המיקרוטום.

לאחר שנוצרו חתכים יציבים ואחידים, עצרו את התהליך. לאחר מכן השתמשו במברשת דקה כדי להסיר חלקים חתוכים ופסולת. כעת התקן גם את גלגל הסרט המצופה וגם גלגל איסוף ריק על מערכת איסוף קטעים דקים במיוחד אוטומטית.

אבטח את מנגנון הנעילה ובצע ניסוי כדי לוודא תנועת סרט חלקה במהירות קבועה ואיסוף נכון על גלגל הלקח. טבלו את ראש האיסוף של מכשיר האיסוף המודבק באמבט המים של סכין היהלום וכווננו את הראש כך שיהיה מקביל לקצה הסכין באורך של 1.5 פעמים מאורך הפרוסה של הדגימה. אבטח את מכשיר האיסוף והמשך בחתכים, תוך כדי הפעלת מכשיר איסוף הסרטים בו-זמנית.

לאחר איסוף מספיק חתכים רציפים, עצרו את החיתוך. חתוך את הסרט באזור ללא חתכים. הרץ את מכשיר איסוף הסרט עד שכל הסרט יידבק על הסליל.

לאחר מכן, הסר את הסליל והכניס אותו לתנור ייבוש אלקטרוני. נקה את מכשיר איסוף הסרטים ואת המיקרוטום והחזיר את כל האביזרים למקומותיהם הנכונים. להתקנה על וופר סיליקון, יש להסיר את הסרט המגן השקוף מהסרט המוליך הדו-צדדי.

מרחים את הסרט במקביל לסרט המוליך הדו-צדדי, ומניחים עד שלושה קטעי סרט על כל חלק. הניחו את וייפר הסיליקון על הבמה של המיקרוסקופ האופטי, וקבעו אותה עם דבק שאינו שאריות. השתמש בעדשת אובייקטיב של חמישה X כדי לקבל תמונת סקירה של וופרת הסיליקון, הסרט והדגימה.

על תמונת הסקירה, השרטט כל קטע ומיין אותו, ואז הוסיף נקודות פוקוס וחשיפה כדי לבצע הדמיה אוטומטית בהגדלה של 20 או 50 פעמים על פני כל הווייפ. אחרי ההדמיה, שמור את התמונות ובדוק את האיכות שלהן, מיקוד מחדש והדמיה מחדש אם יש כאלה מחוץ לפוקוס או איכות ירודה. ייבא את מחסנית התמונות של TIFF ל-VAST 22 על ידי בחירת ייבוא, ואז ייבוא נפח תמונה מהתמונות לקובץ VSV.

חבר טאבלט חיצוני והשתמש בכלי המברשת ובמצב ציור מקטעים כדי לסגמנט ולעקוב ידנית אחרי מבנים. השתמש בקיצורי הדרך A ו-Z כדי לנווט בין פרוסות התמונה. כעת, הצג את המבנה המפוצל בתלת-ממד על ידי בחירת חלון, אחריו צופה תלת-ממדי, תצוגה ועדכון.

לבסוף, שמור את תוצאות הסגמנטציה לאחר בחירת קובץ ושמור סגמנטציה. בתמונות עם רפלקטיביות גבוהה, אזורי הציטופלזמה והוסקולר הראו עוצמה גבוהה יותר לעומת האזורים הסובבים, בעוד שבתמונות עם רפלקטיביות נמוכה, אזורי הלומן הציטופלזמיים והוסקולריים הציגו עוצמה נמוכה יותר. תוצאות כמותיות הראו כי אסטרטגיות ההחזר הגבוה וההשתקפות הנמוכה.

לכל אחת מהן היו יתרונות מבחינת ניגודיות ואנטרופיית מידע. הדמיית מיקרוסקופיה אופטית של OMLIT אפשרה זיהוי אקסונים, כלי דם, גופי תאים ודנדריטים. סגמנטציה ידנית של תמונות חביתה, באמצעות VAST, הראתה גופי תאים, דנדריטים ואקסונים מסודרים בצפיפות רבה.

התוצאות המחולקות שולבו עם התמונה המקורית ליצירת ויזואליזציה תלת-ממדית. תמונות OMLIT מוגדלות הראו רזולוציה לא מספקת לחשוף מבנים עדינים יותר. תמונות מיקרוסקופ אלקטרוני של אותו אזור חשפו סינפסות, מיטוכונדריה, גרעיני תאים ווזיקולות.