איתור של פוסט translational שינויים על nucleosomes אינטקט Native ידי ELISA

המטרה הכללית של הליך זה היא לקבוע באופן מדויק את הרמות היחסיות של מודיפיקציות פוסט-טרנסלציוניות בתוך תכשירים של נוקלאוזומים תאיים כוללים שהופקו ממיליון תאים. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תרביות הומוגניות באיכות גבוהה של תאי יונקים. לאחר מכן, גרעינים מבודלים מהתאים באמצעות פירוק מכני בעזרת הומוגניזר Dounce וצנטריפוגציה.

השלב הבא הוא השגת נוקלאוזומים שלמים באמצעות עיכול הכרומטין שנמצא בתוך הגרעינים וביצוע סדרה של מיצויים היפוטוניים. לבסוף, בוחנים את הנוקלאוזומים באמצעות בדיקת ELISA עם הביקרות המתאימות כדי לזהות מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות ספציפיות. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את הרמות היחסיות של מודיפיקציות ספציפיות הנוכחות בדגימות הנוקלאוזומים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כגון western blotting ושיקוע חיסוני של כרומטין (chromatin immunoprecipitation) הוא שניתן לקבל בקלות תמונה גלובלית של מספר מצבי מודיפיקציה של נוקלאוזומים. השיטה רגישה ומדויקת הרבה יותר מ-western blotting וניתן לבצעה ברוב המעבדות המצוידות לניסויי ביולוגיה מולקולרית כללית. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחומי תאי הגזע והאפיגנטיקה, כגון המתרחש במהלך אירועי דיפרנציאציה ותכנות מחדש עיקריים.

כדי להתחיל את הפרוצדורה, ראשית בצעו tryps-ization לתאים באמצעות 3 mL של trypsin לכל צלחת של 15 cm כדי לקבל תאים שעברו tryps-inization טרי. הוסיפו 20 mL של PBS butyrate קר מאוד. העבירו את התאים לפפית קונית של 50 mL וסובבו את הפפית בצנטריפוגה כדי לאסוף את התאים ב-1000 RPM למשך חמש דקות, שאבו את העל-נוזל והוסיפו 10 mL של PBS butyrate קר מאוד לשטיפה. סובבו שוב את סספנסיית התאים בצנטריפוגה ב-1000 RPM למשך חמש דקות.

הסיר את הנוזל העליון (supernatant) ושחזר את משקע התאים ב-four milliliters של לביז בופר (lysis buffer) עם מעכבי פרוטאז כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, העבר בפיפטה את התאים להומוגנייזר עם עלי פסטל מסוג B על קרח ובצע הומוגניזציה באמצעות 20 תנועות. לאחר מכן, העבר את ההומוגנאט לשפופרת צנטריפוגה על קרח.

סובב את הדגימה בצנטריפוגה ב-2000 G למשך 10 דקות, בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. הסר את הנוזל העליון (supernatant), המכיל את החומר הציטופלזמי, ובצע השהיה (resuspend).

סספנדו את המשקע בשני מיליליטר של wash buffer C קר עם מעכבי פרוטאז, והניחו בעדינות את החומר שסספנדו מעל כרית סוכרוז (sucrose) בריכוז 30% בנפח של חמישה מיליליטר, בתוך מבחנה קרה לצנטריפוגה. כדי לבודד את הגרעינים, צנטריפגו ב-2,400 G למשך חמש דקות ברוטור מסוג swinging bucket; הגרעינים ינדדו דרך הכרית ושיירי תאים יישארו בממשק. לאחר הצנטריפוגה, הסירו בזהירות את כל נפח הנוזל וסספנדו שוב את הגרעינים ב-250 מיקרוליטר של wash buffer C קר עם מעכבי פרוטאז, והעבירו את הגרעינים למבחנה של 1.5 מיליליטר למיקרוצנטריפוגה.

כדי להתחיל בבידוד הנוקלאוזומים, הוסיפו שלושה מיקרוליטרים של calcium chloride בריכוז 0.1 molar לגרעינים והניחו בבלוק חימום בטמפרטורה של 37 degree Celsius עד להשגת שיווי משקל תרמי. לאחר מכן, הוסיפו שתי יחידות של micro cocal nuclease ב-10 מיקרוליטרים של בופר micro cocal nuclease, והדgridו למשך 12 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. ערבבו לעיתים קרובות באמצעות טיפ פיפטה.

לאחר הדגירה, עצור את התגובה באמצעות 6 µL של sodium EDTA-pH 8 בריכוז 0.5 M, והנח על קרח לקירור. לאחר מכן, סבב את הדגימה בצנטריפוגה ב-2000 ×g למשך ארבע דקות; עם סיום הסבוב, השלף את הנוזל העליון ותלה את המשקע. השהה את הדגימה על קרח למשך שעה ב-300 µL של sodium EDTA בריכוז 0.2 mM, תוך ביצוע פיפוט עדין מדי פעם לערבוב.

לאחר סבב צנטריפוגה ב-3000 G למשך ארבע דקות, בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס, אספו את העלייה (supernatant), המכילה את הנוקלאוזומים החופשיים, לשפופרת צנטריפוגה חדשה ושמרו אותה על קרח לשימוש חוזר בנוקלאוזומים. השעו את המשקע ב-300 µL של 0.2 mM sodium EDTA כפי שבוצע קודם לכן, ודגרו על קרח למשך שעה אחת תוך ערבוב עדין מדי פעם.

לאחר הדגירה, סובב את הדגימה בצנטריפוגה. שוב, שלב את ה-snat שהתקבל עם שאר הדגימה בפעולה בתוך מבחורת המיקרו-צנטריפוגה על קרח. כדי להתחיל את בדיקת ה-Eliza לנוקלאוזומים, טען לוח Eliza בעל 96 בארות בסדרה יורדת של חמישה דילולים סדרתיים פי שניים של נוקלאוזומים ותמיסת ציפוי, החל מ-0.1 µg ל-50 µL בבאר העליונה; יש לטעון את כל סדרות הדילול בשלוש חזרות.

זכרו לכלול בארות עם תמיסת ציפוי בלבד כביקורות. דגרו את הפלטה למשך הלילה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עד למחרת. השתמשו בשוטף פלטות כדי לשטוף את הפלטות עם 200 µL לבארה של 0.5%between 20 ב-PBS בטמפרטורת החדר ארבע פעמים, לסה"כ של 10 דקות.

כעת הוסיפו 100 µL למספר בור של תמיסת חסימה והדגירו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על מערבל סיבובי (rotator). לאחר ההדגרה, הסירו את תמיסת החסימה על ידי ניעור נמרץ של הפלטה כשהיא הפוכה מעל כיור. לאחר מכן, הוסיפו את הנוגדן הראשוני המדולל בנפח של 50 µL למספר בור בתמיסה של 5% PSA ב-0.05% Tween 20 ב-PBS, והדגירו את התמיסה למשך שעה אחת על מערבל סיבובי בטמפרטורת החדר.

לאחר דגירה של הנוגדן הראשוני, שטפו את הפלטות כפי שנעשה קודם לכן באמצעות שוטפת הפלטות. עם סיום הליך השטיפה, הוסיפו 50 µL לבאר של נוגדן משני המצומד ל-horseradish peroxidase, המדולל ב-PBS עם 5%BS, A, ו-0.5%20; דגרו בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת על מערבל סיבובי (rotator). לאחר דגירת הנוגדן המשני, שטפו את הפלטות כפי שנעשה קודם לכן.

השתמשו בשוטף הפלטות לפיתוח הפלטה. הוסיפו 50 µL של תסבס TMB Eliza לכל באר והדגירו למשך 10 דקות. בטמפרטורת החדר, בארי פלטת ה-ELIZA יהפכו לכחולים, ועוצמת הצבע תהיה פרופורציונלית לכמות המודיפיקציות של הנוקלאוזומים הנוכחות בכל באר.

כעת עצרו את התגובה על ידי הוספת 50 µL לבאר של חומצה גופרית רגילה בריכוז 2N. הצבע ישתנה לחום; סובבו את הפלטה בצנטריפוגה ב-1500 RPM למשך שתי דקות כדי להעלים בועות אוויר.

הפלטה מוכנה כעת לכימות באמצעות קורא פלטות קולורימטרי. לבסוף, קראו את הפלטה באורך גל של 450 nanometers וייצאו את התוצאות לניתוח. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי לאחר פיתוחה.

טכניקה זו פתחה את הדלת עבור חוקרים בתחום מחקר תאי הגזע לבחון תגובות אפיגנטיות לאירועי דיפרנציאציה ותכנות מחדש ברמה של כל האפי-פרוטואום.