ספירת אדם בתאי גזע עצביים
22 באוגוסט 2007
ידיעת מספרם המדויק של תאים קיימא נדרש מניפולציות תרבות רבים רקמות. פרוטוקול זה מתאר כיצד להבדיל בין תאים חיים ומתים ולכמת תאים באמצעות hemacytometer. למרות שזה מתאר הספירה האנושית גזע עצביים / מבשר תאים (hNSPCs), ניתן להשתמש בו עבור סוגי תאים אחרים.
כעת אראה לכם כיצד לספור תאי אב עצביים אנושיים; תספרו את התאים כאשר תרצו להעביר אותם לצביעה אימונוכימית או כאשר תרצו לבצע טרנספקציה עם nuclear factor machine. אני משתמשת ב-hemocytometer בניגודיות פאזה בעל רשת קצוות, ובנוסף אנו משתמשים בצבע הנקרא trypan blue. הצבע שימושי מכיוון שהוא מאפשר להבחין בין תאים חיים לתאים מתים.
תאים מתים או גוססים קולטים את הצבע הזה ונראים כחולים. כאשר בוחנים את התאים ב-hemocytometer, תאים חיים מסוגלים לדחות את הצבע, ולכן הם אינם נראים כחולים. באופן זה ניתן לקבוע את חיוניות התאים שלכם; הכינו תמיסה של trypan blue במדיום.
אני עומד להוסיף 20 µL של תמיסת trypan blue לשפרורת epi 0.5 mil זו. לאחר מכן אוסיף 25 µL של מצע גידול. כך שכרגע יש לי 45 µL של תמיסת trypan blue ומצע גידול, כדי שבעת הוספת 5 µL של תרחיף תאים, אקבל דילול של 1:10.
ועכשיו אני עומד להוסיף 5 µL של תרחיף תאים. ראשית, אני אוודא שהתאים התערבבו היטב באמצעות ערבוב ידני (finger vortexing). כעת אני רוצה לוודא שתמיסה זו מעורבבת היטב.
כעת אעלה ואוריד את השולחן מספר פעמים. ולבסוף, אטען כ-12 µL מתליהית התאים הזו לתוך המוציטומטר. יש לו שני פתחים וניתן להשתמש בכל אחד מהם.
לכן, כל שעליכם לעשות הוא להחדיר את התמיסה בפתח זה, והנוזל יישאב על ידי פעולת נימיות. כעת אני מוכן לספור. להלן מבט על ה-hemo cytometer בהגדלה של 10x, וכאן אנו רואים רבע המכיל 16 ריבועים.
וכפי שניתן לראות, אנו יכולים להבחין כאן בתאים חיים ומתים. כאן יש לנו תאים חיים כגון זה, וזה, וזה. ויש לנו גם כמה תאים מתים, כגון זה.
אם תבחינו, התא המת נראה בכחול כהה, בעוד שלתאים חיים יש מעין הילה מסביבם. כעת אספור את כל התאים החיים. אעבור משמאל לימין ומלמעלה למטה.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. כך שיש לנו סך הכל שלושים וששה תאים ברביע זה. לכן, כאשר אני רואה תאים שנמצאים על הגבול של הרביע, למשל לאורך הקו הזה ממש כאן, כדי לשמור על עקביות, אני סופרת תאים שנמצאים על הגבול השמאלי ועל הגבול העליון.
ואני סופר באופן עקבי תאים על הגבולות הללו עבור כל הרביעים ב-hemo cytometer. כעת נחשב כמה תאים יש לנו למיקרוליטר. כדי לעשות זאת, אקח את הממוצע של התאים לרביע, שהוא 38, ואכפיל ב-10, שהוא פקטור הנקבע על ידי ממדי התא.
כמו כן, נכפיל ב-10, שהוא מקדם הדילול במקרה זה. ובסופו של דבר, נקבל את מספר התאים למיקרוליטר. במקרה זה, יש לנו 3,800 תאים למיקרוליטר.
ומכיוון שהשעינו את משקע התאים ב-500 microliters של תמיסה, ניתן לחשב את מספר התאים הכולל. וכעת סיימנו.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לספירת תאי גזע/קדומות עצביים אנושיים (hNSPCs) באמצעות המוציטומיטר. הוא מדגיש את חשיבות ההבחנה בין תאים חיים למתים עבור יישומים שונים של תרביות רקמה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- תרבית רקמות
רקע
- ספירת תאים חיים היא קריטית למניפולציות של תרביות רקמה.
- תאים חיים מסוגלים להדיף צבעים מסוימים, בעוד שתאים מתים אינם יכולים לעשות זאת.
- המוסומטר (Hemacytometer) הוא כלי סטנדרטי לספירת תאים.
- צבע Trypan blue משמש בדרך כלל להערכת חיוניות תאים.
מטרת המחקר
- אספקת שיטה מהימנה לספירת hNSPCs.
- הבחנה יעילה בין תאים חיים למתים.
- סיוע לחוקרים בהכנה לניסויים המשכיים, כגון אימונוכימיה או טרנספקציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בהמציטומטר בניגוד מופע (phase contrast).
- יישום צבע Trippan blue להבחנה בין תאים חיוניים למתים.
- ספירה של תאים תחת מיקרוסקופ.
- הכנה של תמיסת Trippan blue ומדיום.
תוצאות עיקריות
- הבחנה מוצלחת בין תאים חיים למתים.
- כימות מדויק של hNSPCs.
- הדגמה של יעילות הצבע Trippan blue.
- תיקוף של ההמציטומטר כשיטת ספירה מהימנה.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק גישה פשוטה לספירת תאים.
- הואו ישים לסוגי תאים שונים מעבר ל-hNSPCs.
- הבנת חיוניות התאים חיונית להצלחת ניסויי תרביות רקמה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות מדויק של תאי גזע/קדמון עצביים אנושיים (hNSPCs) חיוניים הוא חיוני לביצוע זרימות עבודה ניתנות לשחזור של תרביות רקמה בתהליכי גילוי תרופות למדעי העצבים. פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהימנה של חיוניות התאים ומדידת ריכוזם, ובכך תומך בזריעה עקבית של תאים עבור יישומים המשכיים כגון אימונוציטוכימיה וטרנספקציה. באמצעות סטנדרטיזציה של ההבחנה בין תאים חיים למתים בעזרת Trypan blue וספירה מבוססת המציטומטר, השיטה משפרת את הביטחון החיזוי בשלבים מוקדמים של תיקוף מטרות ובמסלולי פיתוח של בדיקות (assays).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר זריעה מדויקת של hNSPCs לצורך מחקרי מעורבות מטרה (target engagement) ומודולציה של מסלולים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מפחית שונות בבדיקות מבוססות תאים על ידי הבטחת קלט עקבי של תאים חיוניים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מספק נתוני ריכוז תאים כמותיים וניתנים לשחזור, החיוניים לסטנדרטיזציה של בדיקות.
- ערך תפעולי: תומך בהכנה ניתנת להרחבה של תרחיפי תאים עבור פורמטים של סריקה בעלת תוכן גבוה (high-content screening).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: שומר על עקביות של קלט תאי לאורך שלבי המעבר משלב הגילוי לשלבים פרה-קליניים.
- ערך תפעולי: מקל על שיתוף פעולה בין-תחומי באמצעות נהלי ספירת תאים סטנדרטיים.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ותומכת בהכנה אמינה של תאים משלב תיקוף המטרה, דרך אופטימיזציה של בדיקות ועד לבדיקות יעילות פרה-קליניות.
- ביולוגיה של גילוי: מבטיחה מינון תאים מדויק עבור ניסויי תיקוף מטרה הכוללים hNSPCs.
- סריקה: מספקת קלטים של תאים סטנדרטיים וניתנים לכימות, הנחוצים לביצוע בדיקות בעלות הדירות.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני ריכוז תאים חיוניים וספירה כוללת המשמשים לנורמליזציה של תנאי הניסוי.
- מחקר תרגומי: תומכת ברציפות בטיפול בתאים בין שלב הגילוי in vitro לבין מודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מייצגת יכולת ניתנת להעברה, בעלת מורכבות נמוכה, הישימה על סוגי תאים ופרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: משפר את הביטחון החיזויי על ידי מזעור השונות בקלט של ניסויים מבוססי תאים.
- ערך תפעולי: משפר את השחזור והסטנדרטיזציה בין מעבדות וצוותים.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) באמצעות בסיסי בדיקה אמינים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר קידום מותאם סיכון על ידי הבטחת איכות הנתונים בסריקות יעילות מוקדמות.
שיקולי יישום
- דורש מיומנות בסיסית בטכניקות תרבית רקמה ובמיקרוסקופיה.
- תלוי בזמינות של המוצייב (hemacytometer) ובניקוי נכון למניעת זיהום.
- מחייב הכשרה עקבית של המפעיל לצורך בחירה לא מוטה של רבעים וכללי ספירה של גבולות.
- מוגבל על ידי קצב הספירה הידנית; אינו מתאים לאוטומציה של תפוקה גבוהה ללא התאמה.
- מתבסס על דילול וערבוב נכונים כדי להבטיח דגימה מייצגת של תרחיף התאים.
