Passaging אדם בתאי גזע עצביים

שלום, אני סטיב. אני עובד במעבדתו של ד"ר פלאנאגן במחלקה לפתולוגיה ב-uc, Irvine. היום אראה לכם כיצד לבצע פיצול של תאי אב עצביים אנושיים.

טכניקה זו כוללת ציפוי של בקבוק תרבית חדש בתמיסה של פיברונקטין אנושי, הפרדת התאים באמצעות בופר לפירוק תאים (cell dissociation buffer), ניטרול של בופר פירוק התאים באמצעות תמיסת סרום 10%, סרכוז של תגלי התאים, השהיה מחדש של התאים במצע טרי, והעברת תגלי התאים לבקבוק תרבית חדש. במעבדה שלנו, אנו מתרבטים תאי אב עצביים אנושיים על ידי החלפת מחצית מהמצע שלהם מדי יומיים, ומבצעים להם מעבר (passage) בערך פעם בשבוע על ידי פיצול ביחס של אחד לשניים. בעת ביצוע מעבר לתאים, אני עשוי לספור אותם אם ברצוני להשתמש בהם לניסוי אימונוכימיה, או אם אני מעוניין לבצע טרנספקציה עם אפקטור גרעיני.

חשוב להשתמש בתמיסת הפרדת תאים (cell dissociation buffer) בעת אריזת תאים משתי סיבות: ראשית, היא אינה אנזימטית, בניגוד לטריפסין, ושנית, היא עדינה הרבה יותר כלפי התאים. שלום, אנחנו נמצאים כעת בחדר תרביות רקמה, ולפני שאראה לכם איך נראה בקבוק עם תאי אב אנושיים בצפיפות מקסימלית (confluent), אכין תחילה את עמדת תרביות הרקמה. ראשית, אכבה את נורת ה-UV ואדליק את התאורה ואת זרימת האוויר.

בשלב הבא, אחטא את תא המטראות באמצעות 70% ethanol על ידי ריסוס נייר סופג וניגוב של התא. חשוב לרסס נייר סופג ב-70% ethanol ולא את פנים התא ישירות, מכיוון שריסוס ישיר של התא ב-70% ethanol עלול לפגוע במסנן ה-HEPA, שעלותו גבוהה מאוד. לאחר מכן, ארסס את כל הריאגנטים והמכשירים.

ולבסוף, אני ארסס את צינורות הוואקום, ואנחנו מוכנים. בואו נסתכל על התאים הללו. נראה שהתאים הללו נמצאים בערך ב-80% confluence.

אלו הם תאי אב עצביים אנושיים שבודדו מעוברים אנושיים, ואנו מגדלים אותם בבקבוקי T 25. אנו מבצעים להם פיצול בערך מדי שבוע, ביחס של אחד לשניים. אני מוכן כעת לבצע מעבר לתקן (passage) של התאים שלי.

ראשית, אקח בקבוק T 25 חדש שסידרתי למשך ארבע שעות עם פיברונקטין אנושי מ-BD biosciences. הסרתי את תמיסת הפיברונקטין. אשטוף את הבקבוק ב-BBS לפני שאעביר את התאים אל תוך הבקבוק.

כעת אוציא את התאים מהאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות. הנה הם. כעת אסיר את תמיסת השטיפה PBS מהבקבוק החדש שצופה בפיברונקטין אנושי.

כעת אוסיף שני מיליליטרים של מצע מותנה ישן אל הבקבוק החדש. כעת עליי לשטוף את התאים שלי ב-PBS לפני שאוכל להסיר אותם מהמשטח. לכן, ראשית אסיר את שאריות המצע, ואוסיף מיד כ-2 מיליליטר של PBS כדי למנוע מהתאים להתייבש.

אמתין כד שתי דקות לפני הסרת ה-PBS והוספת תמיסת פירוק תאים (cell dissociation buffer), כדי להסיר את התאים מפני השטח של הבקבוקון. כעת אסיר את ה-PBS, ושוב, אנסה להוסיף מיד את תמיסת פירוק התאים כדי שהתאים לא יתייבשו. לפיכך, אוסיף 1.5 mL של תמיסת פירוק תאים.

ובניגוד ל-PBS, אני אוסיף אותו ישירות על התאים ואנסה לכסות שטח פנים גדול ככל האפשר. לכן, אני מזיז את הבקבוק מצד לצד בזמן שאני מוסיף לאט את התמיסה הזו על התאים. כעת אמתחה כחמש דקות עד שהתאים יתחילו להיפרד מהמשטח.

אני אשאיר את הבקבוק בטמפרטורת החדר בתוך המנדף. כפי שניתן לראות כאן, התאים מתחילים תחילה להפוך לעגולים ואז הם מתחילים להיפרד מהפני השטח, ואפשר למעשה לראות שחלק מהתאים כבר צפים. הקשה קלה על דופן הבקבוק תסייע להם להיפרד.

חלפו חמש דקות, וכפי שניתן לראות, התמיסה הפכה לצפופה מאוד בתאים שהסתלקו מהפני השטח. כעת אני אנטרל את השפעתו של בופר הדיסוציאציה של התאים על ידי הוספת 4.5 mils של מצע המכיל סרום. אני אשתמש ב-10% heat inactivated fetal bovine serum במצע D-M-E-M-F 12, ואוסיף אותו ישירות על פני השטח של הבקבוק כדי לוודא שלא נשארו תאים דבוקים.

כעת אבצע פיפטור עדין למעלה ולמטה כדי לשחרר תאים שנותרו. לאחר מכן, אעביר את תמיסת התאים למבחנה קונית של 15 ml. אסחרר את המבחנה במהירות של 1,000 RPM למשך דקה אחת.

כעת הסבב של התאים הסתיים ויש לנו כאן משקע תאים יפה. אני אסיר את מצע הסרום בזהירות רבה, מבלי לנסות להפריע למשקע. לאחר מכן, אני אבצע רסספנסיה למשקע בארבעה mils של המצע.

כעת אנסה לתלה מחדש את המשקע כך שלא יישארו גושי תאים, כדי שהתמיסה תהיה הומוגנית ולא יכילו בה גושים. ומכיוון שאני מבצע פיצול של 1:2, אקח 2 mL מתוך ה-4 mL ואעביר אותם לבקבוק החדש שכבר מכיל 2 mL של מצע מותנה. ולבסוף, אסמן את הבקבוק עם סוג התא, מספר המעבר והתאריך.

זהו מבט על התאים שביצענו להם מעבר לפני חצי שעה. וכפי שניתן לראות, רובם נצמדו למשטח והחלו להוציא שלוחות. זהו כל הדבר.

ועכשיו אני מוכן לספור.