כרומוזום מלכודת הידיעות AP עבור זיהוי לטווח ארוך אינטראקציות DNA

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לגלות ולזהות שותפי DNA המקושרים למרחק רחב. דבר זה מושג על ידי קיבוע, ליזיס של תאים ועיכול של ה-DNA באמצעות אנזים הגבלה ראשון, ולאחריו ליגציה ליצירת DNA כימרי המורכב ממקטעים משני הגנים המקושרים. לאחר מכן, לינקרים מתווספים ל-DNA הכימרי לאחר עיכול הגבלה שני. כדי להקל על הגבירתו, מבוצעת הגברה באמצעות PCR תוך שימוש בפריימרים ספציפיים ללינקר ול-DNA הפיתיון (bait DNA), במטרה להשיג כמויות מספיקות של מקטעי ה-DNA המקושרים. התוצאות המתקבלות מראים את שותפי ה-DNA המקושרים למרחב רחב עם ה-DNA הפיתיון, בהתבסס על ניתוח רצפים של מקטעי ה-DNA שהוגברו.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון לכידה לאישור כרומוזומים או 3C, הוא שניתן להשתמש ב-A-C-T-S-A כדי לזהות ביעילות שותף DNA לא ידוע בעל קשר לטווח רחוק. זאת בעוד ששיטת 3C פותחה לצורך אימות של אינטראקציות שחשדו בקיומן מראש בלבד. כדי להתחיל בפרוטוקול זה, גדלו תאי אדם באינקובטור עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 °C עד להגעה ל-80% עד 90% confluent.

לתצוגה זו משתמשים בתאי לוקמיה חומצית של בני אדם (prom acidic leukemia cells). אסוף את התאים על ידי מזיגתם למבחנה מסוג NOC בנפח 50 מיליליטר וסבב במסנטריפוגה ב-1200 RPM למשך 15 דקות. לאחר הסבב, הסר את המצע באמצעות שאיבה.

הוסיפו חמישה מיליליטרים של מצע תרבית כדי להשעות מחדש את משקעי התאים. לאחר ספירת התאים באמצעות המו-ציטומטר, העבירו כ-1x10⁷ תאים לנפח של 40 מיליליטר של מצע RPMI 1640 המכיל 10% FBS. לאחר מכן, הוסיפו 1.7 מיליליטר של 37% formaldehyde כדי לקבע את הכרומטין המדולל.

דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות תוך써 ניעור עדין. לאחר הדגירה, עצרו את התגובה באמצעות 2.4 milliliters של glycine בריכוז two molar. לאחר מכן, סבבו את הדגימה בצנטריפוגה למשך 15 דקות ב-1200 RPM ובטמפרטורה של four degrees celsius.

לאחר הסרת הנוזל העליון (supernatant), שטפו את המשקע פעם אחת עם 40 milliliters של PBS קר מאוד, ולאחר מכן סובבו את הדגימה בצנטריפוגה כדי להוציא את משקע התאים השטוף. השעיקו את המשקע שנוצר ב-40 milliliters של בופר ליזיס קר מאוד עם מעכבי פרוטאז שנוספו טריים ו-0.1 millimolar PMSF. דגרו את הדגימה בחדר קר עם סיבוב למשך 90 דקות. לבסוף, סובבו את הדגימה בצנטריפוגה במהירות של 2,500 RPM למשך 15 דקות, הסירו את הנוזל העליון והוציאו את הגרעינים המבודדים. השעיקו את הגרעינים ב-0.5 milliliters של one X NEB buffer 3 והוסיפו 15 microliters של 10% SDS.

דגרו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת תוך써 ניעור. לאחר מכן, הוסיפו 45 µL של 20% Triton X 100 כדי לסכך את ה-SDS ודגרו שוב בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת תוך ניעור, ובצעו חלוקה למנות (aliquot) של 1x10⁶. נעשה שימוש בגרעינים, כ-15 µg, עבור עיכול באנזימי הגבלה לתוך 55 µL של תמיסת גרעינים.

הוסף 433 µL של XNEB buffer 3 בריכוז 1X ו-12 µL של BGL 2. כדי להגיע לנפח סופי של תגובת עיכול של 500 µL, דגרו את התגובה בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה. למחרת, השבתו את אנזים ההגבלה על ידי הוספת 95 µL של 10% SDS ובצעו דנטורציה לאנזים על ידי חימום בטמפרטורה של 65 °C למשך 20 דקות.

בתוך מקבץ מים, הוסף שבעה מיליליטרים של תמיסת ליוגציה (ligation buffer) בריכוז 1x ו-360 microliters של 20%Triton X 100. דגרי את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. הורד את הטמפרטורה ל-16 °C והוסף 50 microliters של 400 units per microliter.

T four DNA Ligase. יש להדגיר את תגובת הליגציה בטמפרטורה של 16 °C למשך ארבע שעות ולאחר מכן בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. עם השלמת הליגציה, יש להוסיף 300 µg של proteinase K ולהדגיר בטמפרטורה של 65 °C למשך הלילה.

לאחר מכן, הוסיפו 5 µg של RNAA והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות. טהרו את ה-DNA באמצעות סחירה בפנול-כלורופורם והשקיעו את ה-DNA באיזופרופנול; המיסו את ה-DNA שהושקע ב-150 µL של מים מזוקקים סטריליים. כדי להוסיף לינקרים ל-DNA הכימרי, בצעו תחילה עיכול של ה-DNA על ידי הדגרה של 2 µg DNA מטוהר עם 5 יחידות של msp, one בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע עד שש שעות. לאחר העיכול, נטרלו את פעילות ה-MSP one בטמפרטורה של 65 °C למשך 10 דקות.

לאחר מכן, שקיעו את ה-DNA באתנול עם מיקרוליטר אחד של גליקוגן בריכוז five milligrams per milliliter. המיסו את משקע ה-DNA שהתקבל ב-50 microliters של מים מזוקקים סטריליים. לאחר מכן, ערבבו 50 microliters של DNA שעובד ב-MSP one עם שני מיקרוליטרים של אוליגונוקלאיד מקשר L בריכוז 20 micromolar ומיקרוליטר אחד של אוליגונוקלאיד S בריכוז 20 micromolar, ואז הוסיפו מיקרוליטר אחד של מים מזוקקים סטריליים ו-six microliters של T4 DNA Ligase buffer בריכוז 10X.

כסו את התערובת בשעווה נוזלית. דנטורו את האוליגונוקלאוטידים ב-50 °C למשך דקה אחת והניחו להם להתרכב באופן הדרגתי עד ל-10 °C במדרג של 0.5 °C לדקה. באמצעות תרמוסייקלר, הוסיפו 1 µL של T4 DNA ligase בריכוז 400 units/µL והדגירו את התגובה ב-15 °C למשך הלילה.

ביום למחרת, טהרו את ה-DNA המחובר למקשר (linker ligated DNA) באמצעות ערכה לטיהור מהיר של PCR (kaya quick PCR purification kit) והעבירו אותו ב-50 µL של מים מזוקקים סטריליים. לאחר מכן, בחרו פריימר עבור אזור ה-DNA הספציפי שייבדק לאינטראקציות לטווח ארוך. בדוגמה זו, Abel ישמש כפריימר או כפיתיון (bait).

הכינו את ה-DNA המזוכה לסבב ה-PCR הראשון על ידי ערבוב של 1 µL מה-DNA המזוכה עם 1 µL של פריימר ספציפי ל-able one בריכוז 20 µM, 46 56, ו-1 µL של פריימר ספציפי ללינקר בריכוז 20 µM, 29 63. לאחר מכן, הוסיפו 3 µL של תערובת (cocktail) של 3x ClinTech, DNA polymerase one אשר עורבבה מראש עם 32 P-D-C-T-P בהתאם לפרוטוקול הכתוב, ולאחריה 3 µL של מים מזוקקים סטריליים. בצעו הגברה ב-PCR באמצעות מחזור תרמי של hot start PCR כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב לאחר השלמת מחזור ה-PCR.

טהרו את תוצרי ה-PCR מהסבב הראשון באמצעות ערכה לניקוי PCR מהיר של Kaya. בצעו אלוציה ל-30 µL של מים מזוקקים סטריליים. השתמשו ב-1 µL של תוצר ה-PCR הראשון, מדולל פי 100, לביצוע סבב שני של PCR באמצעות פריימרים מקננים (nested primers), על ידי הוספה של 1 µL של פריימר ספציפי ל-able one בריכוז 20 µM, 46 26, ו-1 µL של פריימר ספציפי ללינקר בריכוז 20 µM, 29 61.

שוב, הוסיפו 3 µL של ClinTech 3x, DNA polymerase, one cocktail ו-3 µL של מים מזוקקים סטריליים. בצעו את סבב ה-PCR השני באמצעות תוכנית מחזורי תרמיים של 25 מחזורים של 95 °C למשך 20 שניות, 67 °C למשך 40 שניות ו-72 °C למשך דקה אחת, ולאחריהם שלב הארכה ב-72 °C למשך חמש דקות.

בצעו ויזואליזציה של תוצרי ה-PCR על ידי הרצת ג'ל urea 5% וסריקה של המסך החשוף במכשיר phospho imager. ניתן להוציא כל פס PCR מהג'ל על ידי המסה של רצועות הג'ל בתוך מבחנה מסוג einor המכילה 60 µL של מים מזוקקים סטריליים ודגירה בטמפרטורה של 95 °C למשך חמש דקות. צנטריפוגו את תוצרי הג'ל המומסים קצרות ב-10,000 RPM למשך 10 שניות.

לאחר איסוף כל הדגימות, יש להוציא 1 µL לשימוש כתבנית DNA לביצוע PCR עם הפריימרים 29 61 46 26.

באמצעות אותם תנאים שתוארו לעיל, לאחר טהירה ניתן לבצע ניתוח רצף באמצעות כלי מקוון כדי לקבוע את המיקום הכרומוזומלי. עם ההגעה לאתר הביואינפורמטיקה של הגנום, יש ללחוץ על blatt כדי לפתוח חלון חדש ולהדביק את רצף ה-DNA. לאחר הגשת רצף ה-DNA, יופיעו תוצאות החיפוש של BLATT.

לחצו על ה-browser בתוצאה עם 100% identity כדי לחשוף את מיקום רצף ה-DNA. אזור ה-able one שימש כפיתיון כדי לקבוע את אינטראקציות ה-DNA ארוכות הטווח שלו. שני אתרי BGL II ואתר BAM HI אחד נבחרו לבדיקת A CT. בסיבוב השני של ה-PCR, נעשה שימוש בסט הפריימרים 46 26 29 61 כדי להגביר את able M1, ב-46.30 29 61 עבור able M two, וב-46, 36 29 61 עבור able M three.

תבנית ג'ל טיפית חושפת פס אחד עד מספר פסים, כפי שמוצג כאן עבור able M1, able M two, ו-able M three. רצף ה-DNA של השבט able M1 מוצג כדי להדגים שכל פרגמנט מבדיקת A CT מורכב משני מקטעי DNA משולבים. מקטע אחד נגזר מאזור ה-bait DNA בעוד שהמקטע השני מגיע מהשותף (partner) הקשור.

המקטעים מחוברים זה לזה באמצעות רצף הזיהוי של אנזים ההגבלה הראשון. רצף הזיהוי של האנזים השני יופיע בקצה רצף השותף המשויך. מקטע ה-M1 הניתן לשיבוט מכיל DNA מאזור ABLE one הממוקם בכרומוזום תשע Q 32.4, והשותף המשויך ממוקם בכרומוזום שלוש P שלוש, אשר זוהה כ-proc two.

באופן דומה, השותף המזווג של able M two מומקם בכרומוזום five Q 21.1, בעוד ש-clone able M three זוהה כאסוציאציה תוך-כרומוסומלית סמוך לאטרוס ABLE one, בניגוד לבדיקות three C. המתודולוגיה המתוארת בסרטון זה תבחר את האינטראקציות ארוכות הטווח השכיחות ביותר. עם זאת, על ידי הגדלת מספר מחזורי ה-PCR R, ניתן לזהות גם אסוציאציות נוספות פחות שכיחות. באמצעות שימוש באזור ההטבעה והבקרה או ICR בלוכס IGF two H 19 כ-bait DNA בתאי פיברובלסט של עכבר, הוחלו תוכניות מחזוריות שונות בסבבים הראשון והשני של ה-PCR בבדיקת A CT.

ניתן להשתמש בבדיקת A CT גם כדי לזהות הבדלים בארכיטקטורה הגרעינית ובאינטראקציות למרחקים ארוכים בין תאים נורמליים לתאי סרטן. רקמת מעי גס נורמלית ורקמת סרטן של מעי הגס עברו הומוגניזציה, ובדיקת A CT בוצעה על פי הפרוטוקולים המתוארים כאן. מוצג כאן מבנה ה-DNA של אזור ה-ICR בלוקוס H 19 של IGF two והגן dpn של IGF two.

שני אתרים עבור בדיקת A CT; הפריימרים המסומנים המשמשים בסבב השני של ה-PCR מסומנים על ידי חצים ומספרים בצבעים שונים. תבנית הג'ל של בדיקת A CT מייצגת את תוצאות ה-PCR באמצעות פריימר 29 61 עם כל אחד מזוגות הפריימרים 41, 61, 41 63, 51 45, ו-51 51. פסים ייחודיים המופיעים רק ברקמת מעי גס תקינה מסומנים בחצים צהובים, ואותם פסים שהופיעו רק ברקמת סרטן של המעי הגס מסומנים בחצים אדומים לאחר הפיתוח.

טכניקה זו סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה המולקולרית לחקור את הארכיטקטורה הגרעינית ואת ויסות הגנים באופן תלת-ממדי.