תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא מיפוי של גששים (probes) של DNA על כרומוזומי פוליטן של יתושים באמצעות הכנת כרומוזומים בלחץ גבוה, ולאחריה היברידיזציה פלואורסצנטית אוטומטית ב-in situ ודימוג אוטומטי. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת פריסות של כרומוזומי פוליטן בשיטת לחץ גבוה. השלב הבא של הפרוצדורה הוא הכנת גששים פלואורסצנטיים על ידי סימון של DNA גנומי עם פלואורוכרום באמצעות פרוטוקול של Nick translation.

השלב השלישי הוא ביצוע היברידיזציה פלואורסצנטית ב-situ באמצעות מערכות אוטומטיות לצביעת סליידים. השלב הסופי הוא סריקה וצילום של כרומוזומים מסומנים באמצעות מערכת דימות פלואורסצנטית אוטומטית. בסופו של דבר, התמונות יכולות להראות את המיקום של גשש DNA מסומן פלואורסצנטית על גבי הכרומוזום הפולי.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון פרוטוקול סטנדרטי ידני של היברידיזציה במקום (in situ hybridization), הוא שפרוטוקול המיפוי הפיזי בעל התפוקה הגבוהה ביותר מפיק תוצאות עקביות יותר ומצמצם באופן דרמטי את זמן העבודה הידנית. פרוטוקול זה מתחיל בדיסקציה של נקבות בערך 25 שעות לאחר הזנת דם, כדי לאסוף את השחלות שלהן כאשר הן נמצאים בשלב שלוש (stage three). בשלב זה, לאזור השקוף עם תאי הסיעוד בתוך הזקיקים צריכה להיות צורה עגולה; אסוף שחלות מחמש נקבות וקבע אותן ב-500 µL של תמיסת קרנויז (Carnoy's solution) משונה שהוכנה טרייה.

ניתן לאחסן אותן בטמפרטורת החדר למשך עד 24 שעות, או למשך זמן רב יותר בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. לאחר מכן, רגע לפני הכנת סליידים של חיתוכי שחלה, הכין תמיסת Carnoy וחומצה פרופיונית 50%. הנח כל זוג שחלות בטיפה של תמיסת Carnoy טרייה על סלייד נקי מאבק תחת מיקרוסקופ דיסקציה.

בצעו פיצול של השחלות באמצעות מחט דיסקציה. העבירו את כל חלקי השחלה לשש slides נקיות המכילות 50% propionic acid. הפרידו בין הזקיקים באמצעות מחטי דיסקציה.

לאחר מכן, נגבו שאריות רקמה באמצעות נייר סופג. הוסיפו טיפה נוספת של 50% propionic acid והמתינו שלוש עד חמש דקות. הערה: השראת הזקיקים ב-50% propionic acid למשך שלוש עד חמש דקות משפרת באופן משמעותי את פריסת הכרומוזומים.

בשלב הבא, הנח זכוכית כיסוי והמתן דקה נוספת להתפשטות הגרעינים. עטוף את הפיתה בנייר סינון ובפלסטיק. כוון מכשיר Dremel למהירות שבין 3,000 ל-5,000 RPM, ובמשך כדקה, סובב קלות את קצה ה-Dremel המסתובב כנגד זכוכית הכיסוי.

יש לאשש את איכות הפריסה באמצעות מיקרוסקופ פאזה ולהמשיך בשימוש בדרמל למשך זמן ממושך יותר במידת הצורך, כדי להשטיח את הכרומוזומים. הניחו זכוכית כיסוי שנייה בסמיכות לראשונה, ולאחר מכן הצמידו את זכוכיות הכיסוי באמצעות זכוכית כיסוי נוספת. לאחר מכן, עטפו את הלשוניות בגיליון פלסטיק ובנייר סינון, והניחו את הלשוניות העטופות במלחציים כדי להפעיל עליהן לחץ של בין 85 ל-120 inch pounds.

לאחר יישור הכרומוזומים בכל ששת השקופיות, הסירו את העטיפה מהשקופיות והסירו את השקופיות העודפות כדי ליישר את הכרומוזומים עוד יותר. דגרו את השקופיות בטמפרטורה של 55 °C למשך 10 עד 15 דקות במערכת דנטורציה והיברידיזציה לשקופיות. לאחר מכן, טבלו שקופית בחנקן נוזלי למשך 15 שניות לפחות או עד להפסקת הבעבוע.

לאחר מכן, הסירו במהירות את זכוכית הכיסוי בעזרת להב תער וסנפרו מיד את הפלסטרה לתוך ethanol 50% קר למשך חמש דקות. חזרו על תהליך זה עבור כל פלסטרה באופן רצף. בצעו דהידרטציה לפלסטרות באמבטיות של ethanol 70%, 90% ו-100%.

טבול אותן בכל אמבט למשך חמש דקות. לבסוף, לאחר שהשקופיות התייבשו באוויר, הן מוכנות לצביעה. מכשיר אוטומטי מבצע את מרבית השלבים בפרוצדורה, למעט סימון הגשש.

לפני טעינת המכשיר, הכינו את הגשש הפלואורסצנטי על ידי סימון ה-DNA האחורי עם הפלואורוכרום באמצעות פרוטוקול תרגום NIC מסחרי. לאחר הכנת הגשש, טענו את השקופיות והריאגנטים למערכת הצביעה האוטומטית של השקופיות ותכנתו את המערכת לבצע את השלבים הבאים. ראשית, ספקו 800 µL של 1XPBS למשך 20 דקות.

שנית, ייבשו את השקופיות באמצעות נשיפת אוויר. שלישית, קבעו את השקופיות עם 450 µL של 4%formalin ב-one XPBS למשך דקה אחת. לאחר מכן, שטפו את השקופיות עם 100%ethanol למשך שנייה אחת, פעמיים, ולאחר מכן למשך שתי דקות.

לאחר רחצון באתנול, ייבשו שוב את השקופיות באמצעות נשיפת אוויר. כעת, חממו את השקופיות בטמפרטורה של 45 °C למשך שתי דקות כדי למנוע היווצרות בועות. לאחר מכן, טפטפו 20 µL של הגשוש (probe) ל-DNA, ולאחריו טיפה של שמן מינרלי וכיסוי זכוכית; לאחר מכן, דגנו את הכרומוזומים בטמפרטורה של 90 °C למשך 10 דקות.

לאחר מכן, הגדירו את השקופיות להיברידיזציה בטמפרטורה של 42 °C למשך 14 שעות. לאחר ההיברידיזציה, בצעו שטיפות מחמירות למשך שתי דקות ב-42 °C, ולאחריהן ארבעה יישומים רצופים של 2X SSC למשך שנייה אחת וייבוש. לאחר מכן, יישמו 800 µL של 0.4X SSC ב-42 °C למשך 10 דקות פעמיים, ולאחר מכן שטיפה אחת נוספת ו-2X SSC ב-25 °C למשך 10 דקות.

כעת יש להחיל את הצבע: 50 µL של yo-yo one, ולאחריו שמן מינרלים וזכוכיות כיסוי. דגרו את השקופיות בטמפרטורה של 25 °C למשך 10 דקות. לאחר מכן, הסירו את זכוכיות הכיסוי.

שטוף את העגיות ב-two XSSC ארבע פעמים למשך שנייה אחת לכל שטיפה וייבש אותן בעזרת נשיפה. לבסוף, מרח 15 microliters של prolonged gold anti fade reagent על כל עגיה והצמד כיסויי זכוכית חדשים. הפעל את מערכת הסריקה האוטומטית Accord plus, החל מספק הכוח Olympus U-R-F-L-T עבור נורת הלוגן.

לאחר מכן את המחשב, ולבסוף את המיקרוסקופ עם התקן המצלמה. כעת פתחו תחילה את חבילת התוכנה duet, הגדירו סריקה מקדימה של 10x. לחצו על כפתור ה-online, הזינו מזהה מקרה (case ID) חדש והקצו מזהה לסלייד (slide id).

לחצו על הנקודה המסומנת ב-bf. זוהי אפשרות השדה המואר (brightfield). בחרו באפשרות סריקה של 10 x pre-scan.

בחרו 2, 500 x עיגול, 10, 000 x עיגול או מלבן. לחצו על set והפעילו את התוכנית. לאחר מכן, עקבו אחר ההנחיות כדי להתאים את הסריקה כראוי ולחצו על finish.

כדי להתחיל את הסריקה, לחצו על הלשונית הראשית כדי לחזור למסך הראשי. כעת לחצו על כפתור ה-offline, אתרו את מזהה המקרה (case ID) ואת מזהה השקופית (slide ID) שהוקצו, ולחצו על offline.

סרקו את הריבוע השחור באזור השמאלי העליון. לחצו על חץ ובחרו ב-10 x pre-scan. השתמשו בחצים כדי לעבור בין התמונות שנסרקו לאחר מציאת תמונה רלוונטית.

לחצו לחיצה כפולה על המסך במרכז האזור המיועד ולחצו על snap. פעולה זו תסמן תמונה לצילום מאוחר יותר, לאחר בחירת כל המטרות. לחצו לחיצה ימנית על כל תמונה, לחצו על classify, בחרו 10 x pre-scan ובחרו polytan.

חזרו לתפריט הראשי והגדירו סריקה מקדימה של 40x. בחרו שוב ב-online ובחרו שקופית. שנו את ה-BF ל-ffl ושנו את שם המשימה ל-revisit dash X 40 dash rg.

שנו את הסעיף שנמצא מיד מתחת להגדרה האחרונה ל-revisit dash all. לאחר מכן הפעילו את התוכנית ופעלו לפי ההנחיות. כדי להגדיר את האוטומציה, לחצו על כפתור start matching views כדי לבצע התאמה בין תמונות ב-10x ו-40x.

לחצו על finish כדי להתחיל את הסריקה. עם סיומה, לחצו על classify והתבוננו בתמונות. הכנות של כרומוזומים פוליטנים מתאי סיעוד שחלאיים מנקבות anomaly Gambia בוצעו באמצעות טכניקת הלחץ הגבוה.

שיטה זו אינה פוגעת או משנה את רוב מבנה הכרומוזום. היא מיישרת כרומוזומים מכופפים ובכך חושפת פסי צביעה עדינים וחבויים שאינם נראים בהכנות רגילות. הכרומוזום נסרק באמצעות שיבוטי DNA של back שהושגו מספריית ה-back של anomaly S Gambia nd Tam.

הספרייה הופקה מזכרים ונקבות בשלב הלרבה של הכוכב (star larva) של זן המזיק anomaly S Gambia. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע מיפוי פיזי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה כדי להקל על פיתוח מהיר של הרכבות גנום מבוססות כרומוזומים.