מסלולי לימוד Cell רולינג על דפוסי קולטן אסימטרית
13 בפברואר 2011
אנו מתארים פרוטוקול להתבונן ולנתח מסלולי מתגלגל תאים על מצעים בדוגמת אסימטרית הקולטן. את הנתונים המתקבלים שימושיים ההנדסה של הקולטן בדוגמת מצעים להפרדה-תווית חינם התא ניתוח.
פרוטוקול זה בוחן ומנתח מסלולי גלגול של תאים על תבניות רצפטורים אסימטריות, כדי להקל על הנדסת תסני תבניות רצפטורים להפרדה ולניתוח תאים ללא סימון. התהליך מתחיל בהדפסה במיקרו-מגע (micro contact printing) של מולקולות PEG על תסנית זהב כדי ליצור תבניות לסירוגין של שכבות מונחים בעצמן (self-assembled monolayers), ולאחר מכן מילוי של שאריות התסנית ברצפטורים של P select. לאחר מכן, שולבים את התסנית בתא זרימה. מזרימים את תאי ה-HL 60 אל תוך התא.
הקליטו רצף תמונות של אינטראקציית הגלגול של תאי HL 60 על דפוסי P selectin ונתחו את התמונות שהומרו מהווידאו. ניתן לקבל את מסלולי התאים הגולגלים, אורך מעקב של קצה התא ומהירויות גלגול על פני המישור, האזור והקצה באמצעות תוכנת MATLAB. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האופן שבו תאי HL 60 נעים על דפוסי קולטנים אסימטריים בזרימה גזית.
ניתן ליישם זאת לכימות של אינטראקציות אחרות על פני שטח תאים, לניתוח ישיר של התאים באמצעות תצפית על מסלוליהם על גבי תבניות קולטנים, ולתכנון של התקני מיקרו-הנחיה (micro footing) להפרדת תאים. הדפסת מגע מיקרוסקופית (Micro contact printing) משמשת ליצירת תבניות לסירוגין של שכבות מונומולקולריות בהרכבה עצמית של מולקולות peg על מצע הזהב.
ראשית, יש לדייג את חותמת ה-PDMS עם תמיסת PEG בריכוז חמישה מילימולר באתנול. ייבשו את הפני השטח למשך 20 דקות. הניחו בעדינות את החותמת על פני השטח של הזהב למשך 40 שניות וודאו שיש מגע טוב בין פני השטח של הזהב לחותמת.
אין צורך בלחץ עודף. שטפו את הפני השטח באתנול וייבשו תחת זרם של חנקן. כעת, באמצעות תא פרפוזיה, דגרו את התשמיות עם תמיסת P selectin בריכוז 15 micrograms per milliliter למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר כדי לדגמן את השטחים הנותרים ב-P selectin, שטפו את התא, ולאחר מכן מלאו מחדש את הפני השטח ב-BSA בריכוז one milligram per milliliter למשך שעה אחת כדי לחסום אינטראקציות לא ספציפיות.
שטפו את הפני השטח עם תמיסת DPBS לפני ביצוע ניסוי גלגול התאים. הרכיבו את תא הזרימה ולאחר מכן הזרימו תרחיף של 10⁵ תאי HL 60 למילליטר מעל תבניות הפני השטח, בתוך תא זרימה מלבני עם זוויות נטייה של 10 מעלות עבור תבנית הרספטורים.
בטמפרטורת חדר של 24.5 °C. כוון את משאבת המזרקים ליצירת קצב זרימה של 75 µL לדקה, עם מאמץ גזירה למינרי תואם של 0.5 dines/cm². כעת, בעזרת מיקרוסקופ הפוך ומצלמה מותקנת, הקלט את גלגול תאי HL 60.
אינטראקציות עם דבקים, p-selectin ותשתיות. השתמש בעדשה עם הגדלה של 4x בקצב של פריים אחד לשנייה למשך 300 שניות. בצע שלושה ניסויים עצמאיים.
הציגו את הנתונים כממוצע וסטיית תקן של ערכי הממוצע שהתקבלו מכל ניסוי. תמונות מיקרוסקופיות שהומרו מהווידאו של HL 60.Rolling. אינטראקציות עם דבק p-selectin ומצעים מראות אזורים בהירים וכהים המתאימים למסעפי p-selectin ולאזורי PEG, בהתאמה.
מסלולים מתוחמים כאן באמצעות תוכנית MATLAB מותאמת אישית. זווית נטיית השפה הייתה 10 מעלות ומאמץ הגזירה היה 0.5 dines לסנטימטר רבוע. ניתוחים נוספים בוצעו על התפלגות אורך מעקב השפה, הערך הממוצע של אורך מעקב השפה, וכן VE ו-VP, מהירויות הגלגול על השפה ובתוך הרצועות.
לאחר צפייה בסרטון זה, תבואו לידי הבנה טובה של האופן שבו בוחנים מסלולי תאים על דפוסי קולטנים אסימטריים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה בוחן ומנתח מסלולי גלגול של תאים על תבניות רצפטורים אסימטריות, כדי לסייע בתכנון של תשבורי תבנית רצפטורים להפרדה ואנליזה של תאים ללא סימון.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- ביומטריאלים
- מיקרופלואידיקה
רקע
- גלגול תאים הוא תהליך קריטי באינטראקציות ביולוגיות שונות.
- דפוסי רצפטורים אסימטריים יכולים להשפיע על התנהגות התא.
- טכניקות ללא סימון (Label-free) חיוניות להפרדה ולניתוח של תאים.
- הדפסת מגע מיקרוסקופית היא שיטה שימושית ליצירת מצעים בעלי דפוסים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול לתצפית על גלגול תאים על מצעים בעלי תבנית קולטנים.
- ניתוח מסלולי הגלגול של תאים לצורך הנדסת מצעים משופרת.
- אספקת תובנות לגבי דינמיקת תנועת תאים תחת תנאי זרימה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הדפסת מיקרו-מגע (Micro contact printing) של מולקולות PEG על תשתית זהב.
- יצירת תבניות לסירוגין של מונושכבות המרכיבות את עצמן (self-assembled monolayers).
- מילוי השטחים הפתוחים בתשתית באמצעות P-selectin וקולטנים.
- שילוב בתא זרימה ודימוג של תאי HL-60 המתגלגלים על התבניות.
תוצאות עיקריות
- הוקלטו רצפי תמונות של אינטראקציות בין תאי HL-60.
- מסלולי התנועה של תאים במצב גלגול נותחו באמצעות MATLAB.
- נתונים על אורך מעקב קצוות ומהירויות גלגול הושגו.
- סופקו תובנות לגבי תנועת תאים על תבניות קולטנים אסימטריות.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר ניתוח מפורט של דינמיקת גלגול תאים.
- ניתן להנדס תבניות קולטנים אסימטריות לצורך הפרדה יעילה של תאים.
- שיטה זו תורמת להבנת התנהגות תאים בזרימה גזירה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הבנת מסלולי גלגול של תאים על דפוסי קולטנים אסימטריים מאפשרת תכנון רציונלי של התקני הפרדה מיקרופלואידיים ללא סימון. פרוטוקול זה מספק נתונים כמותיים על אורך מעקב הקצה ומהירות הגלגול תחת מאמץ גזירה מוגדר, ובכך תומך במידול חיזוי של התנהגות תאים בזרימה. תובנות אלו מפחיתות את הצורך בחזרות אמפיריות בהנדסת התקנים עבור תהליכי טיהור תאים וניתוח פנוטיפי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של קינטיקת קישור ליגנד-רצפטור תחת גזירה פיזיולוגית, ובכך מספק מידע לצורך תיקוף מטרות של מסלולים המתווכים על ידי הידבקות.
- ערך תפעולי: מספק שיטה ללא סימון להערכת פעילות רצפטור תפקודית ללא תגי פלואורסצנציה או דיווחים גנטיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר קריאות כמותיות של מהירות גלגול תאים ואורך מעקב של קצוות לצורך ניתוח השוואתי בין צפיפויות קולטנים או גיאומטריות של תבניות.
- ערך תפעולי: מסנכרן את הכנת התשתית באמצעות הדפסת מיקרו-מגע (microcontact printing) ושילוב תא זרימה לצורך בדיקות הידבקות הדירות.
מחקר תרגומי וטרום-קלמיני
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים של אסטרטגיות הפרדה מבוססות היצמדות, על ידי קישור תכנון דפוסי קולטנים לתוצאות נצפיות של מסלול תאי.
- ערך תפעולי: מאפשר סריקה של פנוטיפים תאיים על בסיס התנהגות גלגול, דבר המועיל להעשרת תתי-אוכלוסיות במודלים פרה-קליניים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה מתאימה לשלבי הגילוי המוקדמים כדי להנחות את פיתוח הבדיקה ויצירת כלים פרה-קליניים, במיוחד עבור מטרות שבהן היצמדות תחת זרימה מהווה מדד תפקודי.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת בדיקת היפותזות של אינטראקציות רצפטור-ליגנד בזרימה גזירהית, ובכך מבהירה תרומה מכניסטית של גלגול תאים.
- סריקה: מספקת מדדי היצמדות כמותיים וסטנדרטיים המאפשרים השוואה בין שורות תאים או מודולטורים של רצפטורים.
- אנליטיקה: מפיקה התפלגויות של אורך מעקב קצוות ומהירות גלגול, המספקות בסיס סטטיסטי להשוואת תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין דינמיקת גלגול in vitro לשימוש פוטנציאלי במכשירי הפרדת תאים ללא סימון עבור עיבוד דגימות פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה רב-פעמית להערכת התנהגות תאים המתווכת על ידי היצמדות במגוון יעדים וסוגי תאים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במנגנוני הפרדה מבוססי היצמדות על ידי כימות פרמטרי מסלול תחת גזירה מבוקרת.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות הדפסת מיקרו-מגע סטנדרטית, מילוי אחורי של רצפטורים והקמת תא זרימה.
- ערך אסטרטגי: מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים של פיתוח המכשיר על ידי מתן אפשרות לתיקוף תפקודי של דפוסי רצפטורים בשלבים מוקדמים.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בהחלטות go/no-go עבור טכנולוגיות הפרדה מיקרופלואידיות באמצעות אספקת נתונים אמפיריים על ביצועי הדפוס.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהדפסת מיקרו-מגע (microcontact printing), כימיה של משטחים ובקרת זרימה מיקרופלואידית.
- תלוי בגישה למיקרוסקופיה הפוכה בשדה בהיר, מצלמה מהירה וכלים למעקב אחר חלקיקים מבוססי MATLAB.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של ייצור המצע ודיווח על תנאי הזרימה לצורך שחזור תוצאות בריבוי אתרים.
- התאמה לסוגי תאים חלופיים מחייבת תיקוף של זוגות ליגנד-רספטור ואופטימיזציה של פרמטרי מאמץ גזירה (shear stress).
- מוגבל בשל האופי החולף של אינטראקציות שולי-תא, המגביל שחזור מלא של המסלול ומחייב ניתוח מקטעי.
