הסיליקון מיקרוצ'יפים עבור מניפולציה Cell-cell אינטראקציה

שלום, אני אליוט הו. אני עמית פוסט-דוקטורט במעבדה של טיה כאן במכון הטכנולוגי של מסצ'וסטס (MIT). היום נכין תרביות תאים על שבבים מיקרו-מכניים מסיליקון. ההתקנים נראים כמו מסרקים קטנים הננעלים זה לתוך זה, והם מאפשרים לנו לבקר במדויק את האינטראקציות בין שתי אוכלוסיות שונות של תאים.

היום נלמד על האינטראקציה בין הפטוציטים של הכבד לתאי סטרומה תומכים. באופן ספציפי, תאי פיברובלסט 3T3 תורגלו על פני השטח העליון של המסרקים, כך שעל ידי הזזת שיני המסרק, ניתן להזיז את התאים ולשנות את הסידור המרחבי שלהם. כל התקן מחולק לשני חלקים הננעלים זה בזה בשתי תצורות אפשריות.

הראשון מביא את שתי אוכלוסיות התאים למגע זו עם זו. השני מפריד מעט בין שתי האוכלוסיות כך שהתאים אינם יכולים לגעת זה בזה. במצב זה, אינטראקציות מגע נמנעות, אך אינטראקציות באמצעות גורמים מפרישים נשמרות.

נתחיל בדון על האופן שבו יש לטפל בחלקים באמצעות פינצטות. אני ממליץ להשתמש הן בפינצטות טפלון גדולות והן בפינצטות מתכת קטנות בעלות קצה עגול. באמצעות הפינצטות הגדולות, ניתן להרים את החלקים מהדפנות; בחלקים גדולים יותר בעלי זרועות, יש להיזהר לא לשבור את הזרועות כיוון שהן שבירות מאוד.

אם כן, יש להרים אותם מהחלק האחורי של הרכיב באופן זה. באמצעות פינצטה ממתכת, ניתן להגיע אל תוך החור ולהרים את השבבים ישירות. הרכיבים הגדולים יותר יתאימו לבאר בלוחית 12 באריים, בעוד שהרכיבים הקטנים יותר יתאימו ללוחית 24 באריים או שניתן יהיה לשלב אותם עם הרכיב הגדול יותר.

בפלטה של 12 בארות, אני משתמש בדרך כלל בפינצטה ממתכת. כאשר אני מטפל בחלקים בתוך הפלטות כדי לחבר שני חלקים זה לזה, אני בדרך כלל מכניס תחילה את החלק הגדול יותר אל הבאר ודוחף אותו עד לקצה של צד אחד. לאחר מכן, אני לוקח את חלק התיקון המשלים ומניח אותו בצד השני של הבאר, ואני דוחף אותם זה לעבר זה באמצעות שתי פינצטות, אחת בכל חור.

כעת אני יכול פשוט לנעול את החלקים יחד, או בתצורת מרווח או בתצורת מגע. אם אני רוצה להפריד בין החלקים, אני מעדיף למשוך את החלקים לתצורת המרווח ולאחר מכן למשוך אותם למעלה בצורה אנכית כדי להסיר את החלק. כעת, מכיוון שההתקנים עשויים מסיליקון, יש לצפות אותם כדי לאפשר הידבקות תאים תקינה.

סביר להניח שתקבלו את המכשירים כאשר הם כבר מצופים בפוליסטירן ומטופלים בפלזמה, לכן נניח שזו נקודת ההתחלה שלנו. ראשית, נשתמש בקולגן כדי לצפות את הפני השטח שאליהם ייצמדו ההפטוציטים. נניח את מסרקי ההפטוציטים בתמיסה של קולגן בריכוז 50 µg/mL ונדגור בטמפרטורה של 37 °C למשך 45 דקות.

מנגד, אין צורך לציות את מסרקי הפיברובלסטים. לאחר הדגירה, אנו שואבים את תמיסת הקולגן ושוטפים במים. כעת ננעיל את ה-ES יחד במגע עם החלקים המשלימים, כדי ליצור משטח שטוח לזריעת תאים.

ראשית, נמלא מספר בארות ב-70% ethanol. אני אשים זוג בכל בארה ולאחר מכן אנעל אותם יחד. לאחר הנעילה, נרצה לבחון את החלקים תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהם קו-מישוריים.

מדי פעם החלקים עלולים להינעל זה לזה ללא יישור מדויק. במיקרוסקופ ניתן יהיה לראות שהם נמצאים בשתי מישורי מיקוד שונים. במקרה זה, פשוט הפרידו את החלקים והחזירו אותם יחד. לאחר בדיקה שהיישור תקין, נניח לחלקים להישאר באתנול למשך זמן מה לצורך עיקור.

לעיתים קרובות אני ממהר, ולכן אני פשוט משרה למשך 10 דקות. לאחר הסטריליזציה, יש לשטוף את השאריות. שאבו את האתנול ביסודיות ושטפו במים, לאחר מכן שאבו ושטפו במים פעם נוספת, ולבסוף שאבו את המים והחליפו אותם במצע הגידול שלכם.

כעת נבצע זריעה של תאים על ההתקנים. בדרך כלל, אנו תולה את התאים בריכוז של 500,000 תאים למילליליטר, ומעבירים באמצעות פיפטה מיליליטר אחד של התליה מעל כל זוג מסרקים באמצעות פלטה בעלת 12 בארות. לפיכך, זרענו את הפיברובלסטים בריכוז של 500,000 תאים למילליליטר בשתיים מהבארות.

באופן דומה, לקחנו תרחיף של 500,000 hepatocytes לכל באר והזרקנו אותם לשתי הבארים האחרות. כעת, לפני ההדגרה, ננער את התאים היטב כדי להבטיח שהם יתפזרו באופן אחיד. אני נוהג לנער שלוש פעמים אנכית, שלוש פעמים אופקית, ולאחר מכן לחזור על הפעולה הזו שלוש פעמים.

לאחר הנעורה, נניח את הדגימה באינקובטור ונמתין 15 דקות, ולאחר מכן ננעור אותן שוב. לאחר נעורה בכל 15 דקות למשך שעה אחת, נשאב את תגלי השארית של תרחיף התאים ונניח תרחיף תאים חדש. נחזור על פעולה זו עד לקבלת שכבה סמיכה (confluent) של תאים.

בדרך כלל, עם פיברובלסטים, הדבר דורש פריסה אחת או שתיים. עם הפטוציטים, הדבר עשוי לדרוש שתי עד ארבע פריסות. כדי להגיע לשכבה חד-שכבתית רציפה (confluent monolayer), התאים נפרסים בצפיפות גבוהה למדי; ניעור מבטיח שהתאים יתחלקו באופן שווה.

לאחר הזריעה הראשונה, נוצרת שכבה דלילה של תאים. שימו לב שהתאים נצמדים רק לאצבעות שצופו בפוליסטירן ובקולגן. לאחר זריעת תאים טריים ודגירה למשך שעה נוספת, שוב עם ניעור מדי 15 דקות, שכבת התאים הופכת לצפופה יותר.

לאחר הזריעה השלישית, הושג צפיפות תאים טובה, וכעת ניתן להפסיק לאחר שהתאים נזרעו על המסרקים. ברצוננו להוביל את התאים לתצורה הניסויית הרצויה. ההתקנים מופרדים כעת מהחלקים המשלימים שלהם ומודגרו למשך 24 שעות.

לאחר 24 שעות, התאים התפשטו ויצרו שכבה אחת רציפה (monolayer) על פני המסרקים. כעת נרצה ליצור תרבית משותפת (co-culture). מסרק ההפטוציטים ומסרק הפיברובלסטים מועברים כעת לאותה באער ונעולים יחד בתצורה ראשונית רצויה.

במידה ורצון. לאחר פרק זמן מסוים, ניתן לשנות את התצורה. לדוגמה, ניתן לעבור לתצורת מרווח לאחר 18 שעות, כאשר החלקים מונחים באותו מקום, נדחפים יחד היטב עד להגעה לתצורת המרווח, ואז נדחפים למגע בחזרה לתצורת המרווח.

כעת נסיר מסרק אחד. השלב הבא יהיה תהליך של הסרת ציפוי הפוליסטירן הישן, ניקוי השבבים, ולאחר מכן הנחת ציפוי פוליסטירן חדש והכנתו לתרבית תאים. שוב, על ידי הסרת ציפוי הפוליסטירן הישן והנחת שכבה חדשה, אנו מבטיחים ששום דבר מהניסוי הקודם לא יפריע לניסוי החדש.

לאחר סיום הניסוי, הדבר הראשון שיש לעשות הוא להלבין את התאים ולאחר מכן לשטוף את המסרקים במים. לפני הכנסת השבבים לתוך המכשיר, יש לוודא שהם יבשים לחלוטין. כאן ישנם מספר מסרקים שהשארתי לייבש באוויר למשך זמן מה, ואני בודקת שהם יבשים לגמרי.

כעת ניקח מעט toluene ונכניס אותו לבקערת זכוכית זו. נשתמש כאן בפיפטת זכוכית כדי למנוע המסה. toluene ממיס פלסטיק, לכן איננו יכולים להשתמש בפיפטת פוליסטירן טיפוסית.

בסדר, זה מספיק. כעת ניקח כמה מחלקים אלו, נניח אותם בתוך הtoluene, ואני אפעיל את השייקר כדי ליצור ערבוב, ונכסה את הכלי בנייר אלומיניום כדי למנוע מהtoluene להתאדות. לאחר שעתיים, ה-toluene אמור היה להמיס את רוב הפוליסטירן שעל המסרקים, ואנו יכולים פשוט להוציא אותם ולייבש את המסרקים באוויר.

לאחר שטיפת ההלווין (Halloween rinse), החלקים צריכים להיות נקיים יחסית משאריות פוליסטירן. עם זאת, עלינו להביא את החלקים לרמת ניקיון קיצונית, שכן אם הם אינם נקיים לחלוטין, שכבת הפוליסטירן החדשה לא תהווה הידבקות טובה. הפוליסטירן נוטה להתקלף במרכז הניסוי כאשר התאים מתחילים למשוך אותו.

כעת נבצע ניקוי באמצעות חומצת פירנה (piranha acid). הנחתי את החלקים בתוך כלי זכוכית ואנו נחמם אותם, לכן נניח את הכלי על פלטה מחממת.

וכאן יש לנו חומצה גופרית ומי חמצן. אני אשפוך תחילה את החומצה הגופרית, וכאן, אדאג שכל השבבים יהיו טבולים תחת הנוזל. לעיתים יש להם נטייה לצוף.

כיוון שאנו עובדים כעת עם כימיקלים קורוזיביים למדי, ודאו שאתם לובשים את ציוד המיגון המתאים. כאן, אני לובש כפפות ניטריל. כעת נשפוך את המימן פראוקסיד אל תוך החומצה, ושימו לב שזו תגובה אקסותרמית.

ניתן לראות שיש מעט עישון בעת התגובה, אך אנו מעוניינים להוסיף אנרגיה למערכת כדי להפוך אותה למגיבה יותר. לכן, כעת נחמם אותה ל-120 °C; בטמפרטורה של בערך 120 °C תוכלו להיות בטוחים שכל שאריות תרבית התאים ינוקו לחלוטין מהשבבים. בשלב זה, יש להניח לתגובה להסתיים במלואה עד שכל המימן פחמון (hydrogen peroxide) ינוצל.

בשלב זה, התערובת תפסיק לבעבע. לכן, התגובה אורכת כחצי שעה עד להשלמתה. לאחר שלא תראו יותר בועות, ניתן פשוט לכבות את הפלטה החמה ולהניח לה להתקרר.

כעת נעביר אותם למים עם BAK curve. ושוב, ודאו שאתם משתמשים בפינצטת טפלון כאן, לא במתכת; ניתן פשוט להרים אותם ולהעבירם. כעת נשטוף אותם תחת זרימה קבועה של DDH₂O. בדרך כלל אני לוקח זאת ישירות מהברז ונשאיר את הזרימה פועלת למשך 10 דקות לפחות.

ובאופן זה, נשטוף את כל שאריות החומצה לאחר הקיצוץ תחת זרם מים למשך 10 דקות. יש להסיר את החומצה מהשבבים, ונשמור אותם תחת מים עד למועד שבו נהיה מוכנים לצפות את הפוליסטירן, פוליסטירן במשקל מולקולרי של 45,000 שקיבלנו מ-Sigma. נשקול כאן כמות קטנה ממנו.

יש לנו 400 milligrams ואנו נהמס אותם בטולואן בריכוז של 100 milligrams למילילטר. לכן, יש לעבוד עם הטולואן בתוך מ 빠르게. בנוסף, מכיוון שנעשה שימוש בטולואן כדי להמיס פוליסטירן, עלינו לוודא שאיננו משתמשים בציוד מעבדה העשוי מפוליסטירן.

כעת נשתמש במבחנה קונית מפוליפרופילן ובפיפטת זכוכית. מכיוון שיש לי 400 milligrams של פוליסטירן, אני אוסיף ארבעה milliliters של טולואן. כעת נערבב את התוכן ב-vortex למשך חצי שעה עד להמסה של הפוליסטירן. נבצע ערבוב של המבחנה ב-vortex במהירות הנמוכה ביותר למשך כ-20 דקות עד חצי שעה.

כעת אחבר את המבחנה למכשיר הוורטקס. אין צורך להחזיק אותה שם לאורך כל הזמן. לאחר 20 עד 30 דקות, הפוליסטירן אמור להיות מומס ונשכל להיות מוכנים לציפוי.

כעת נבצע ציפוי ספין (spin coating) לפוליסטירן במעבדה שלנו. מכשיר ה-spin coater שלנו נמצא בחדר נקי. לכן, עלינו ללבוש כאן כיסוי ראש, משקפי מגן, חלוק, כיסויי נעליים וכפפות, אך הדבר עשוי להיות שונה במעבדה שלכם.

לפני השימוש במחבז זה, אני רוצה להגן עליו מפני הפוליסטירן. לכן, נכסה אותו בנייר אלומיניום, ונשתדל להצמידו למשטח בצורה השטוחה ביותר, כדי שהשבב יוכל להישען בצורה מיושרת על פני השטח. ננקב חור קטן בדיוק במרכז כדי שנוכל לשמור על ואקום על השבב.

הספין קודר (spin coder) מוגדר ל-2,400 RPM ול-30 שניות. כעת נוכל לקחת את אחד השבבים שלנו, להניחו כך שמרכז השבב מכסה את החור, ואני אשאיר את הוואקום כבוי בהתחלה בעת הנחת הפוליסטירן, לאחר מכן אפעיל את הוואקום ואתחיל את הספין. עבור חלקים קטנים יותר, ניתן להטיל פחות מ-10 טיפות.

עבור החלקים הגדולים יותר, נשתמש במעט יותר מ-10 טיפות של פוליסטירן. נסובב את הדגימות במשך 30 שניות במהירות של 2,400 RPM. כעת ניקח את השבבים המצופים בפוליסטירן ונכניס אותם לתנור בטמפרטורה של 120 °C. טמפרטורה זו היא מעל נקודת מעבר הזכוכית של הפוליסטירן.

בכך יתרחש תהליך של הזרימה מחדש של השטח כדי להחליקו מעט, וכן תדחוס ותתקשח הפלסטיקה. לכן, בדרך כלל אני משאיר זאת בתנור למשך הלילה. התהליך דורש ככל הנראה לפחות מספר שעות כדי להסתיים.

לאחר אפייה למשך לילה, השבבים מוכנים לטיפול בפלסמה. כעת נחפוץ את הפוליסטירן לפלסמת חמצן, מה שישנה את אנרגיית הפנים כדי שחלבונים ותאים יידבקו אליה טוב יותר. נטען את השבבים לתא הפלסמה ונשאב את האוויר ליצירת ואקום.

הגדרה טובה לשימוש היא 200 mil, תור של ואקום ו-200 watts של הספק למשך דקה אחת תחת זרימה של גז חמצן. כעת, לאחר שהמערכת נשאבה, נכניס את החמצן. אוקיי, כעת נוכל להפעיל את הספק ה-RF ולהדליק את הפלסמה למשך דקה אחת.

כאשר הפלסמה פועלת, היא למעשה זוהרת. זה דומה לנורת פלורסצנט. לאחר דקה אחת של חשיפה לפלסמה, נחזיר את הלחץ לרמה אטמוספרית ונוכל להוציא את החלקים.

כעת החלקים מוכנים לציפוי בחלבון ולהזנת תאים. המטרה בתכנון מכשיר זה הייתה לאפשר לנו להשפיע על המבנה המיקרו-ארכיטקטוני של הרקמה באופן דינמי. לכן, הארגון המיקרוסקופי של הרקמה בגוף, ובמיוחד מיקום התאים ביחס זה לזה, הוא חשוב מאוד לקביעת התפקוד של כל תא ספציפי בתרבית מעבדה.

עד לא מזמן, לא יכולנו לשחזר זאת בצורה טובה, אך במהלך חמש או עשר השנים האחרונות, אנשים התחילו להיות מסוגלים לבצע תבנית מיקרוסקופית של תאים על מצע לתרבית רקמות, ובכך למקם תאים בדיוק היכן שנרצה שהם יהיו בצלחת תרבית רקמות. ובמעשיו, הם הצליחו לגלות כמה היבטים חשובים של הביולוגיה הבסיסית של אינטראקציות בין תאים בקנה מידה מיקרוסקופי. כעת, מה שלא יכולנו לעשות עד לנקודה זו הוא לבצע זאת באופן דינמי.

פירוש הדבר הוא שינוי הארגון של תרבית תאים במהלך הניסוי. דבר זה חשוב כיוון שבגוף, הרקמה אינה למעשה סביבה סטטית. ישנם תאים שנעים ומתארגנים מחדש, במיוחד בתהליכי ריפוי פצעים או בהתפתחות.

אך אפילו באיבר תקין במצב של הומאוסטזיס, ישנם מרכיבים רבים הנעים סביב. ההיבט הטכני הקשה ביותר ללמידה הוא פשוט כיצד להניע פיזית את החלקים. ובתחילה, כשמתחילים לעבוד עם המערכת, ייתכן שתרגישו מוטרים מהמידה שבה החלקים שבירים או מהתנועות הקטנות שאתם נדרשים לבצע.

אך אני סבור שאם תתרגלו עם המכשיר למשך זמן קצר, לא תיתקלו בקשיים משמעותיים. חלק מהמקרים שבהם מכשיר זה ממלא תפקיד, למשל בהתפתחות עוברית, הם כאשר תאים באים במגע עם סדרה של סביבות תאיות שונות בעודם מנבטים דרך שכבות עובריות שונות. ידוע כי האינטראקציות עם כל אחת מהשכבות, ככל שהן באות במגע באופן רצפי, דוחפות אותנו הלאה במסלולו של תהליך בידול ספציפי.

לפיכך, אנו סבורים כי סוג זה של התקן עשוי להתאים לניסיונות לשחזר אירוע מסוג זה במעבדה. אחד ההיבטים של הארגון המיקרוסקופי שרצינו לבחון במיוחד היה ההבדל בין תאים המתקשרים באמצעות אינטראקציות של מגע, שבהן קרומי התאים יכולים להיות צמודים זה לזה, לבין גורמים ממיסים המופרשים למצע הסובב ומדיפים לעבר תא שנמצא במרחק רב יותר. במקרים רבים שבהם תאים נמצאים בתרבית משותפת (co-culture) והם משפיעים זה על זה, לא היה ברור אם מדובר באינטראקציות של מגע או בגורמים מופרשים הממלאים תפקיד זה.