עיצוב מכשירי microfluidic ללימוד ותגובות ניידות תחת בית או להתאבדות כימית / חשמל / שאר מתח גירויים
13 באוגוסט 2016
התקנים מיקרו-מיוצרים המשולבים עם רכיבים נוזליים מספקים פלטפורמה במבחנה למחקרי תאים המחקים את המיקרו-סביבה in vivo. פיתחנו שבבים מיקרופלואידיים מבוססי פולימתיל-מתאקרילט לחקר תגובות תאיות תחת גירוי מתח כימי/חשמלי/גזירה יחיד או קיים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לתכנן ולייצר מכשירים מיקרופלואידיים להתבוננות כיצד תאים מגיבים לגירויים סביבתיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של התא ובהנדסה ביו-רפואית. כגון כיצד תאים מגיבים תחת גירויים סביבתיים שונים כולל כימיקלים, מתחי גזירה ושדה חשמלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לייצר ולהרכיב צינורות בקלות. וזה המכשירים המיקרופלודיים הללו עשויים להפוך את המצב in vivo עם יכולות מעולות גבוהות. ידגימו את ההליך צו-יואן צ'ו, סטודנט לתואר ראשון מהמעבדה שלי, והסיין-סאן הו, פוסט-צוות מהמעבדה של ד"ר ג'וליאן צ'ונג. כדי להתחיל, הפעל את סופר הלייזר של פחמן דו חמצני ובדוק את חיבורו למחשב. לאחר מכן טען תבנית עץ חג המולד שצוירה מראש, כמו אחת הדפוסים המוצגים כאן לתוך הסופר. לאחר מכן, הניחו גיליון PMMA או פיסת סרט דו צדדי על גבי הבמה של הסופר. כוונן את המיקוד של לייזר הפחמן הדו חמצני באמצעות מוט הכיול ולייזר הניאון הליום הנראה. לאחר מכן כתבו את התבנית על המצע. בסיום, הרם את מצע התבנית, הסר את החלקים הלא רצויים והשתמש בזרם חנקן כדי לנקות את פני השטח מכל הפסולת שנותרה. חזור על תהליך זה עבור כל רכיב בשבב. הרכיבו את השבב המיקרופלואידי של מתח הגזירה הכימי. כדי להשיג זאת, חבר שלוש גיליונות של יריעות PMMA בדוגמת מתח גזירה כימי באמצעות שתי חתיכות של סרט דו צדדי כתוב. השתמש בדבק סופר כדי לחבר מתאמי אקריליק עם הברגים באמצע לשכבת ה-PMMA העליונה ביותר של השבב על ידי יישור חוטי הברגים והחורים. מתאמים אלה ישמשו כיציאות כניסות בינוניות ומחברי גשר מלח. לאחר מכן הוסיפו חתיכה אחת נוספת מהסרט הדו-צדדי בעובי 07 מ"מ לתחתית השבב, והצמידו את השבב לצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ. לאחר ההרכבה, הכניסו את השבב לתא ואקום למשך הלילה. כעת הרכיבו את שבב השדה הכימי-חשמלי. חבר את גיליון ה- PMMA הכתוב לשבב השדה הכימי-חשמלי עם סרט דו צדדי לצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ. לפני השימוש בשבבים, חשפו אותם ל-UV למשך 30 דקות כדי לעקר אותם. לאחר מכן, חבר את כניסות הצ'יפס למזרקים מלאים ב-PBS של 3 מ"ל באמצעות צינורות פלסטיק ואומים אטומים לאצבעות. באותו אופן, חבר את השקעים לצינור פסולת. לחץ לאט על הבוכנה על המזרק כדי לטשטש את תעלות הנוזל עם PBS. דחפו את המזרק קדימה ואחורה כדי להסיר בועות, ואז הכניסו את הצ'יפס לתוך חממה למשך הלילה. כדי להגדיר את שבבי השדה הכימיים-חשמליים, מלאו 3% אגרוס באגוזים הצינוריים כדי להגדיר את גשרי המלח. לאחר מכן הנח את אלקטרודות כלוריד כסף כסף לתוך האומים הצינוריים. לגדל תאי סרטן ריאות CL1-5 ב-D-MEM בתוספת של 10% FBS עד שהם מגיעים למפגש של 90%. ואז שאפו את המדיום. שטפו את התאים פעם אחת עם PBS מחומם מראש. והוסף 2 מ"ל של תמיסת חיץ 05% טריפסין לצלחת בקוטר 10 ס"מ. החזר את התאים ל-37
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג התקנים המיוצרים במיקרו-פבריקציה המשולבים עם רכיבים פלואידיים, היוצרים פלטפורמה in vitro למחקרי תאים, המדמה באופן הדוק את המיקרו-סביבה in vivo. המחקר מתמקד בשבבים מיקרופלואידיים מבוססי polymethylmethacrylate שתוכננו לבדיקת תגובות תאיות לגירויים שונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרופלואידיקה
- ביולוגיה תאית
- מחקרים in vitro
רקע
- התקנים מיוצרים במיקרו-סבסב (Micro-fabricated devices) משפרים את חקר הסביבות התאיות.
- רכיבים פלואידיים מאפשרים בקרה מדויקת של התנאים הניסיוניים.
- הבנת התגובות התאיות חיונית עבור יישומים ביולוגיים שונים.
- פולימתילמתאקרילט הוא חומר רב-שימושי ליישומים של מיקרופלואידיקה.
מטרת המחקר
- פיתוח פלטפורמה לבחינת תגובות תאיות בסביבה מבוקרת.
- חיקוי תנאים in vivo באמצעות טכנולוגיה מיקרופלואידית.
- חקירת השפעות של גירויים כימיים, חשמליים ומעמדי גזירה (shear stress) על תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- תכנון וייצור של שבבי מיקרופלואידיקה באמצעות polymethylmethacrylate.
- שילוב של רכיבים פלואידיים לשם שיפור הבקרה הניסויית.
- החלת גירויים שונים להערכת תגובות תאיות.
- ניסויים in vitro לסימולציה של תנאי in vivo.
תוצאות עיקריות
- פיתוח מוצלח של שבבי מיקרופלואידיקה למחקרים תאיים.
- הדגמה של היכולת לשלוט בתנאי הסביבה באופן יעיל.
- צפייה בתגובות תאיות מובחנות לגירויים שונים.
- אספקת תובנות לגבי האינטראקציות בין תאים לבין המיקרו-סביבה שלהם.
מסקנות
- הפלטפורמה המיקרופלואידית היא כלי בעל ערך לחקר התנהגות תאית.
- הממצאים תורמים להבנת התגובות התאיות בסביבה מבוקרת.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול בדיקת תרופות ומידול מחלות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
פלטפורמות מיקרופלואידיקה המאפשרות בקרה מדויקת על גירויים כימיים, חשמליים ומאמצי גזירה, מספקות למחקר ופיתוח בתחום הביו-פארמה גישה ניתנת להרחבה להפחתת סיכונים בתיקוף מטרות (target validation) באמצעות חיקוי של מיקרו-סביבות in vivo מורכבות. התקנים אלו, המבוססים על PMMA, מגבירים את התפוקה הניסיונית לסריקת תגובות תאיות תחת גירויים בו-זמניים, ובכך תומכים בהבנה מכניסטית בשלבי הגילוי המוקדמים. הטכנולוגיה מסייעת בתעדוף מטרות עם רמת ביטחון ניבויית גבוהה יותר, בטרם הקצאת משאבים לזיהוי מובילים (lead identification).
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של תגובות תאיות למדרגי ריכוז כימיים, שדות חשמליים ומאמץ גזירה כדי להבהיר את מעורבותן של מסלולים במנגנוני מחלה.
- ערך תפעולי: מצעי PMMA מאפשרים ייצור מהיר ובעלות נמוכה באמצעות אבלציה בלייזר, מה שתומך בתכנון איטרטיבי בבדיקת היפותזות על מטרות.
- ערך חיזוי: מכמת את ייצור רדיקלי חמצן רבובים (ROS) ואת נדידת תאים תחת גירויים מוגדרים, ובכך מספק מדדים פונקציונליים להפחתת סיכונים במטרות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: יוצר חמישה מדרגי ריכוז במקביל למדרגי מאמץ גזירה או שדות חשמליים, מה שמאפשר סריקה רב-פרמטרית במכשיר בודד.
- ערך תפעולי: מפחית את מספר החזרות הניסיוניות על ידי שילוב של מספר תנאי גירוי, ובכך משפר את יעילות הבדיקה לסריקת ספריות של תרכובות או siRNA.
- יכולת הרחבה: תואם לתהליכי עבודה סטנדרטיים של מיקרוסקופיה ואינקובציה, מה שמקל על האימוץ שלו ברצפי סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: שימוש בתאי סרטן ריאה CL1-5 כמודל רלוונטי למחלה לצורך חקר פנוטיפים המונעים על ידי המיקרו-סביבה.
- הפחתת סיכונים מכניסטיים: בידוד התרומות של גירויים כימיים, חשמליים ומכניים לתגובות תאיות, לצורך גיבוש אסטרטגיות לטיפול משולב.
- הלימה פרה-קלינית: תוצאות כגון נדידה ועקה חמצונית נמצאות במתאם עם מאפיינים הרלוונטיים למטסטזה וליכולת פלישה.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השבבים המיקרופלואידיים משמשים כפלטפורמת בדיקה בשלב הגילוי, המגשרת בין תיקוף המטרה לסריקת מועמדים ראשונית, על ידי אספקת פנוטיפים תאיים כמותיים המגיבים לגירויים.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי האופן שבו רמזים מהמיקרו-סביבה מווסתים התנהגות תאית במודלים של סרטן ומחלות אחרות.
- סריקה: מאפשר בדיקה מקבילה של תגובות תאיות על פני מדרגי ריכוז כימי וגירויים פיזיים, ובכך מגדיל את צפיפות הנתונים לניסוי.
- אנליטיקה: מייצר פלטים מדידים, כולל זיהוי ROS מבוסס פלואורסצנציה ומדדי נדידה ב-time-lapse להשוואה אובייקטיבית.
- מחקר תרגומי: משתמש בשורת תאים של סרטן ריאה גרורתי כדי לקשר בין תגובות למיקרו-סביבה לבין פנוטיפים של פלישתיות הרלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: עיצוב מבוסס PMMA מאפשר שחזור בין מעבדות ופרויקטים להעסקה עקבית של גירויים במחקרי מכנו-ביולוגיה או פרמקולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי מתן אפשרות להחלה מבוקרת של גירויים בודדים או גירויים בו-זמנית כדי לבודד תרומות של משתנים.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הזרמת הגירויים באמצעות יצירת מדרג (gradient) הניתן לשחזור, ובכך ממזער שונות בין חזרות.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי אספקת מדדי יעילות ורעילות רב-פרמטריים תחת תנאים רלוונטיים פיזיולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מטרות מותאם-סיכון על ידי זיהוי תרכובות המווסתות תגובות תאיות ספציפיות לגירוי.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון מיקרופלואידי, אבלציה בלייזר של PMMA והרכבת ממשק פלואידי.
- תלוי בגישה למכונת חריטה בלייזר CO2, סטריליזציה ב-UV וציוד להחלקת נוזלים (priming) כגון מזרקים וצינוריות.
- מחייב סטנדרטיזציה של זריעת תאים, תזמון יישום הגירוי ונרמול קריאות בין הצוותים.
- התאמה לסוגי תאים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של ממדי התעלות וקצבי זרימה כדי לשמור על מאמץ הגזירה (shear stress) ועל שלמות הגרדיאנט.
- מגבלות מעשיות כוללות היווצרות בועות במהלך ה-priming והיפרדות אלקטרודות במערכי שדה חשמלי, כפי שצוין בפרוטוקול.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
1:03
Chip Design and Fabrication
1:57
Chip Assembly
4:37
Cell Preparation and Experimental Setup
6:02
Experimental Setup
7:32
Data Analysis
8:22
Results: The Effects of Chemical Stress, Shear Stress, and Electrical Fields on Lung Cancer Cells
9:47
Conclusion
