Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans

הפרוצדורה מבצעת הגבלה תזונתית על מצע סטנדרטי ב-sea elegance כדי לבחון את השפעתה על אריכות ימים, רבייה ומטבוליזם. הדבר משיג תחילה על ידי מדידה מדויקת של ריכוז החיידקים שישמשו כמקור מזון. השלב השני של הפרוצדורה הוא דילול נאות של תרבית החיידקים לריכוזים מתאימים.

לאחר מכן, הכין מצעי SDR מבוססי ג'ל עם חיידקים שהורגו. לבסוף, הקם ניסויי SDR עם אוכלוסיית תולעים בעלת גיל מסונכרן. תוצאות של מדידות ייצור צאצאים ואורך חיים עשויות להראות ייצור צאצאים מושהה ומופחת, וכן עלייה בממוצע תוחלת החיים.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות כגון Dian במצע AZA, הוא שכל הניסוי יבוצע על מצע AGA מוצק סטנדרטי המשמש במעבדות רבות. עבור ניסויי הגבלה תזונתית, קבעו עקומות כיול נפרדות עבור כל זן חיידקים המשמש כמקור מזון. בחרו מושבה בודדת של חיידקי e coli OP 50 ממריחה טרייה על lb agar והחדירו אותה לשלושה מיליליטר של תרבית נוזלית lb broth במנער בטמפרטורה של 37 °C למשך לילה.

לאחר מכן, מדדו את הבליעה של כל דילול באורך גל של 600 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר, בשלוש חזרות. דללו שוב כל תרחיף חיידקים פי מיליון, והזרקו באופן שווה 0.4 מיליליטר של תרחיף חיידקים מכל דילול על צלחת LB-agri בקוטר 100 מילימטר, והדגירו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 18 עד 24 שעות. ספרו את מספר מושבות החיידקים שגדלו בכל צלחת על מנת לחשב את מספר היחידות יוצרות מושבות (CFU) למיליליטר עבור כל דגימה.

כעת שרטטו את ה-OD 600 כפונקציה של ריכוז החיידקים ובצעו ניתוח רגרסיה ליניארית כדי לבסס את הקשר בין ערכי ה-OD 600 שנמדדו לבין ריכוזי חיידקי OP 50. בשיטה זו, נעשה שימוש בריכוז חיידקים של 1×10¹¹ CFUs למילליטר בתנאי הזנה ad lido וב-1×10⁸ CFU למילליטר כתנאי הזנה אופטימלי של DR. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בארבעה עד שישה ריכוזי חיידקים שונים כדי לבסס קשר מלא התלוי במינון.

עבור SDR ותגובותיו. הכין תמים עם מושבה בודדת של חיידקי e coli OP 50 בשלושה מיליליטר של מצע LB נוזלי, שגודלו בקוצצץ בטמפרטורה של 37 degree Celsius למשך שש עד שמונה שעות. העבר את תרבית ה-OP 50 לבקראך חדש המכיל 500 מיליליטר של מצע LB וגודל למשך הלילה כדי שהחיידקים יגיעו לרוויה, במידת הצורך.

הכינו דילול מתאים של תרבית ה-OP 50 למדידת בליעה ב-OD 600. כדי לקבוע את ריכוז החיידקים, השקיעו את החיידקים על ידי סנטריפוגציה ב-1500 Gs למשך 20 דקות. הסירו את העליון (supernatant) ותלו את החיידקים מחדש לריכוז של 1 × 10¹² CFUs למילליטר.

כעת, הכינו תרביות חיידקים של 10 מיליליטר בשש ריכוזים שונים, הנעים בין 1 × 10⁷ CFU למיליליטר ועד 1 × 10¹² CFU למיליליטר בעזרת פיפטה. טפטפו 0.2 מיליליטר של תרבית החיידקים למרכז פלטת N GM מוצקה בקוטר 60 מילימטר. הימנעו ממגע של חוד הפיפטה עם פני השטח של הפלטה, שכן חריצים על פני השטח מאפשרים לתולעים לחדור לתוך האגראות.

הנח את הצלחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. לאחר מכן, הוסף לכל צלחת 10 µL של carbonic soin בריכוז 100 mg/mL ו-10 µL של can mycin בריכוז 50 mg/mL כדי לעצור את צמיחת החיידקים. אחסן את הצלחות עם ריכוזים שונים של אנטיביוטיקה שהרגו את החיידקים בטמפרטורה של 4 °C לשימוש עתידי למשך עד חודש אחד.

חשוב להכין ולאחסן מספיק צלחות, רצוי מאותה סדרה עבור הצמח כולו. בצעו ניסוי לפחות יום אחד עד יומיים מראש כדי לוודא את חיוניות החיידקים. גרדו מעט חיידקים מתוך צלחות ה-SDR ופזרו אותם על צלחת N GM ריקה עם carbonic, sein ו-antimycin.

הניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שש עד שמונה שעות ואשרו את היעדרם של צמיחת חיידקים. עבור רוב המחקרים הקשורים ל-SDR, כגון ניתוח תוחלת חיים ואפיון ייצור צאצאים, הכנת אוכלוסיית תולעים מסונכרנת גיל היא חיונית. השתמשו בבחור תולעים מפלטינה כדי להעביר 20 עד 30 בוגרים פעילים רבייתית למספר צלחות NGM רגילות.

עם OP 50. בהתאם למספר הביצים הדרושות לניסויים, ייתכן שיהיה צורך במספר רב יותר של בוגרים. השאירו את הצלחות הפטריות בטמפרטורה של 20 °C למשך ארבע שעות כדי לאפשר הנחת ביצים.

הסיר את הבוגרים מהצלחת ובצע בדיקה ויזואלית של הצלחות כדי לאתר ביצים. המשך לדגור את הצלחות בטמפרטורה של 20 °C כדי לאפשר לצאצאים להתפתח לשלב L4 מאוחר או ליום הראשון של שלב הבגרות. בדרך כלל תהליך זה אורך שלושה ימים עבור תולעי N2 מסוג wild type בטמפרטורה של 20 °C.

לניתוח תוחלת חיים. העבירו 10 עד 12 תולעים בוגרות בנות יום אחד לצלחת SDR כדי להתחיל את ההגבלה התזונתית. כדי להשיג עוצמה סטטיסטית מספיקה, השתמשו בסך כולל של 60 עד 100 תולעים עבור כל תנאי SDR.

דרג את החיוניות של כל תולעת מדי יומיים עד שלושה ימים עד שכל התולעים ימותו. חשוב להעביר את התולעים למצעי SDR טריים מדי יומיים כדי למנוע הרעבה. עקום כיול זה מציג את ריכוז ה-OP 50 ביחס ל-OD 600.

ניתן להשתמש במשוואה שהופקה מניתוח רגרסיה ליניארית עבור כל החישובים העתידיים של ריכוזי חיידקי OP 50. מחקר זה בוחן את ההשפעה של טיפולי SDR כרוניים על תוחלת החיים הממוצעת של זני תולעת שונים, בהשוואה לתגובה תלויית-מינון רגילה של תולעי סוג פרא (wild type) ל-SDR. ההשפעה של SDR על תוחלת החיים מדוכאת חלקית על ידי ביטוי יתר של DR two, בעוד שלמוטציה DAF 16 MU 86 אין השפעה על הארכת תוחלת החיים המושרה על ידי SDR.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלולים להבנה טובה של אופן ביצוע Dian במשחק סטנדרטי המבוסס על AGA ב-sea elegance.