דומיין הטרנסממברני Oligomerization הנטייה נקבע על ידי Assay ToxR

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לחקור נטיות לליגמנטיזציה (ligamentization) של חלבונים, דומיינים טרנס-ממברנליים או TMDs, בסביבת ממברנה טבעית. זאת מושג על ידי ביטוי של הדומיין הטרנס-ממברנלי הנבדק ב-e coli כחלבון כימרי עם maltose binding protein לצורך מיקום בפריפלזמה (periplasm), ו-tox R כדווח שעתוקי (transcriptional reporter). ליגמנטיזציה מושרית של הדומיין הטרנס-ממברנלי גורמת לדימריזציה של tox R ולהפעלה של שעתוק LXi. כשלב שני, התאים מולyses ומטופלים ב-ONPG, אשר עובר הידרוליזה על ידי beta galacto למוצר סופג אור, O nitro pholate או ONP.

בשלב הבא, רמות ה-ONP נמדדות על ידי מדידת בליעת אור באורך גל של 405 nanometers. על מנת לקבוע את רמות הדומיין הטרנס-ממברנלי, תוצאות הליגנטיזציה חושפות את נטיית הליגנטיזציה של הדומיינים הטרנס-ממברנליים בהתבסס עלבדיקה של דומיין מדווח tox R. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות ביופיזיות קיימות, כגון SDS page או פלואורסצנציה, הוא שהתנהגות הדומיין הטרנס-ממברנלי נחקרת בשכבה פוספוליפידית טבעית באמצעות ביטוי ב-e coli, ולא במערכת ממברנה חלופית כגון מיסל דטרגנט.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום החלבונים הממברנליים, כגון פיתוח הבנה של מאפיינים מבניים מרכזיים המעורבים באסוציאציה של סלילים טרנס-ממברנליים. לפני תחילת פרוטוקול זה, מוכנים שבעה פלסמידים המבטאים את החלבון הכימרי הנדרש מאוליגנוקלאוטידים שסונתזו מסחרית, המייצגים את ה-TDS הרלוונטי המוקף באתרים NHE one ו-BMH one. לאחר הכנת אתרי ההגבלה של הפלסמידים, מפשירים בעדינות תאי fhk 12 קומפטנטים על קרח. לאחר ההפשרה, מעבירים את התאים למבחנות תרבית של 15 milliliter, מוסיפים 200 nanograms מכל DNA פלסמידי למבחנה נפרדת ומדגירים את התאים על קרח למשך 30 דקות.

לאחר מכן, בצעו הלם תרמי לתאים למשך 90 שניות ב-42 °C, ולאחריו דגירה על קרח למשך שתי דקות ב-800 µL של מצע SOC. דגרו את הדגימות ב-37 °C עם ניעור למשך שעה אחת. לאחר הדגירה, זרעו 50 µL מתערובת הטרנספורמציה לתוך 5 mL של מצע LB המכיל chloramphenicol ו-ampicillin, באמצעות מבחנות תרבית של 15 mL, בשלוש חזרות עבור כל דגימה. לבסוף, דגרו את הדגימות ב-37 °C עם ניעור למשך 20 שעות. כדי למדוד את יעילות הליגציה, נקבעת פעילות ה-β-galactosidase של ה-TDS.

ראשית, חממו מראש את קורא הלוחיות ל-28 °C. השתמשו במלאי של Z buffer להכנת תמיסות Z buffer טריות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. העבירו Z buffer chloroform מהמבחנה למאגר, תוך הקפדה לשאוב באמצעות פיפט רק את השכבה המימית העליונה של ה-Z buffer chloroform.

הנח את פלטת 96 הבארות על דף נייר עם רשת מסומנת כדי להבטיח פיפטור מדויק. העבר 100 µL של Z buffer chloroform לכל בארה בפלטת 96 הבארות, ולאחר מכן 5 µL מכל תרבית בשיטת Quadruplicate. השמט את התרבית מארבע הבארות שישמשו כביקורות ריק (blanks). מדוד את ה-OD 595 של הפלטה כדי לקבוע את צפיפות התאים.

הוסף 50 µL של Z buffer SDS לכל בארות הפלטה. לאחר מכן, נער את הפלטה בקורא הפלטות למשך 10 דקות כדי לליז את התאים; לאחר ליזיס התאים, הוסף 50 µL של ZPA עבור ONPG לכל הבארות. החזר את הפלטה לקורא הפלטות ומדוד OD 405 בכל 30 שניות למשך 20 דקות.

קבע את רמת הפעילות של beta lactamase באמצעות חישוב של יחידות מילר (Miller units) בנורמליזציה למשליל (blank). ביצוע Western blotting נועד לאמת ביטוי חלבוני שווה בין הקונסטרוקטים. ראשית, ערבב 50 µL מתוך התרביות בשלוש חזרות, ולאחר מכן סבב את הדגימות באמצעות מיקרו-צנטריפוגה.

הסר את הנוזל העליון באמצעות פיפטה ושחזר את המשקע. השהה את המשקע שנותר בבופר טעינה של דגימה בריכוז 2x, טען 7.5 microliters מכל דגימה לג'ל סטנדרטי של 8% ובצע אלקטרופורזה ב-125 volts למשך שעה וחמש דקות. לאחר ההעברה, דגרו את הממברנה עם נוגדן מצומד anti M-V-P-H-R-P כדי להדגים את החלבון הכימרי; החלבון נצפה בערך ב-70 kilodaltons, כאשר לעיתים נראים תוצרי פירוק סביב 48 kilodaltons.

MVP אנדוגני נצפה גם ב-45 kilodaltons. כדי להעריך שזריקה תקינה של מבנה ה-TMD הכימרי לממברנה, נעשה שימוש בשורת תאי PD 28 שחסר בה חלבון קושר מלטוז; כאשר תאים אלו גדלים במצע מינימלי שבו מלטוז הוא מקור הפחמן היחיד, רק תאים המבטאים תוצר ביטוי אינטגרלי לממברנה עם חלבון קושר מלטוז הממוקם נכון בפריפלזם יכולים לגדול. יש להעביר גנים (Transform) לתאי PD 28 כפי שמתואר עבור תאי fhk 12 ולהחדיר אותם לשני milliliters של מצע LB.

גדלו את התאים בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור במהירות של 300 RPM למשך לילה לאחר האינקובציה. השקיעו את התאים באמצעות סרצ'פוגציה ושטפו אותם על ידי רסוספנזיה בשני מיליליטר של PBS ופיפוט עדין עם טיפ גדול. לאחר ההשקעה, שטפו את התאים שוב עם PBS פעם שנייה, ולאחר מכן בצעו סרצ'פוגציה סופית ורסוספנזיה במיליליטר אחד של PBS.

השתמש ב-25 µL של התאים לאחר השהייה כדי להוסיף אותם ל-5 mL של מצע מינימלי. דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור למשך 15 שעות. העבירו 200 µL מכל דגימה לפלטה של 96 בארות, ומדדו את ה-OD 5 9 5 באמצעות קורא פלטות.

חזור על תהליך זה מדי שעתיים עד להשלמה של 25 שעות. נטיית הליגציה של דומיינים טרנס-ממברנליים בודדים מהחלבון האינטגרלי רב-מעבר ממברנלי latent membrane protein one נותחה באמצעות מערך הדיווח השעתוקי tox R. דומיין טרנס-ממברנלי חמישי מראה נטייה חזקה לליגציה, כפי שמוכח על ידי יחידות מילר גבוהות, בדומה לבקרת החיובי GPAA, רצף דימריזציה מבוסס.

מוטציה מזיקה בדומיין הטרנס-ממברנלי החמישי D1 50 A מפחיתה את יכולתו של הרצף לבצע ליגציה ל-LMP1; TM1 אינו מבצע ליגציה באופן משמעותי ומציג אות יחידות מילר נמוך מאוד, מעט מעל האות של השליטה (blank), שהם תאי FHK 12 שאינם טרנספורמיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לקבוע אם לסליקס טרנס-ממברנלי שנבחר יש יכולת ליצור קומפלקסים מסדר גבוה בסביבת ממברנה טבעית. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לבצע פיפטור בזהירות רבה לתוך פלטת 96 הבארים כדי למנוע שגיאות גדולות ולהבטיח שלא יוכנסו בועות אוויר.