תפוקה גבוהה הקרנת ו biosensing עם פלורסנט ג elegans מתחים

סרטון זה מדגים שיטה לתרבית ולהגשה של זנים פלואורסצנטיים של CL gans לסריקה בשקיפות גבוהה של ספריות כימיות או לגילוי מזהמים סביבתיים, במטרה להעריך את ההשפעה של חומרים כימיים או גורמים סביבתיים על פעילות של חלבונים ספציפיים. ב-CL elgan, תרבייות חיידקים מוכנות תחילה כמזון עבור התולעים, ולאחר מכן מגדלים תולעים טרנסגניות ל-GFP באופן מסונכרן.

לאחר מכן אוספים, שוטפים ומחלקים בין 0.5 ל-2 מיליון תולעים לתוך 3 פלטות מיקרוטיטר בעלות 84 בארות, ואז מוסיפים לתולעים מולקולות קטנות מספריית כימיקלים או דגימות בדיקה כגון מים, מזון או קרקע. לבסוף, נמדדת הפלואורסצנציה של התולעים באמצעות קורא פלטות מיקרו.

ניתוח נתונים של עצימויות פלואורסצנציה חושף מולקולות קטנות המודולות מסלולים שעתוקיים הניתנים להשראה או מאפשרות זיהוי של מזהמים סביבתיים. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון בדיקות in vitro ובדיקות המבוססות על תרביות תאים, הוא שלא יבוזבז זמן על תרכובות רעילות או שאינן פעילות in vivo. שיטה זו, בעלת תפוקה גבוהה, יכולה לסייע בזיהוי מולקולות קטנות המודולות מסלולים הניתנים להשראה מגוונים.

למרות שפיתחנו שיטה זו לסריקה בשקיפות גבוהה של ספריות מולקולות קטנות, ניתן ליישם אותה גם לביו-חישה של מזהמים במזון ובדגימות סביבתיות. את ההליך ידגימו אנדרו דיין, טכנאי במעבדה שלי, וקו לונג, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. הכינו את מזון התולעים הבקטריאלי מראש.

התחל בהדבקת 500 מיליליטר של terrific broth, המועשר ב-50 מיקרוגרם למילליטר של streptomycin, עם חמישה מיליליטר של e coli. OP 50 רווי. הנח את התרבית על שייקר וגדל אותה למשך לילה ב-37 °C.

ביום למחרת, חלק את התרבית ל-10 מבחנות של 50 מיליליטר. לאחר מכן, הנח את המבחנות בצנטריפוגה מקוררת וסובב במהירות של 2,500 RCF למשך 20 דקות. לאחר הסבוב, השעה כל משקע חיידקי ב-10 מיליליטר של מצע גידול נומטודות נוזלי או NGM.

נער את התרחיפים באופן אופקי. השתמש במנער רצפה במשך 15 דקות כדי להשעות מחדש את החיידקים. לאחר מכן, סבב את תרבית החיידקים בצנטריפוגה ב-2,500 RCF בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius למשך 20 דקות.

שפכו את ה-NGM ושקלו את משקע החיידקים. לאחר מכן, הוסיפו נפח שווה של באפר NGM ותלו את המשקעים על ידי ערבוב ב-vortex. לבסוף, חלקו שלוש מיליליטר של תרבית החיידקים התלויה למבחנות של 15 מיליליטר ואחסנו אותן במינוס 20 מעלות צלזיוס עד למועד השימוש.

בהדגמה זו, יימדד כדוגמה השפעת הלוואת ה-Xeno Duke המשרה סטרס על גורם השעתוק Sskn one. Sskn one ידוע כמעגל של גנים ציטופרוטקטיביים במהלך סטרס חמצוני וסטרס זנובי. תרבית בקנה מידה גדול של שורת ה-Trenchgenic c gans VP 5 96, הנושאת שני מבנים פלואורסצנטיים, מוכנה.

תולעים מסוג VP 5 96 מבטאות הן את מקדם GST four המניע את GFP, המשמש לניטור הפעילות של גורם השעתוק Sskn one, והן את מקדם DOP three המניע את RFP, המשמש כסטנדרט לנורמליזציה של מספר התולעים.

DOP three הוא הפרומוטר של רצפטור דופמין, והוא מבוטא באופן קבוע בנוירונים ברחבי הגוף. בדוגמה זו, בהינתן שהקסנוביוטי מפעיל בעוצמה את sskn one ומגדיל את כמות ה-GFP המבוטא מהפרומוטר GS T four, להכנת התרביות יש להתחיל בשילוב של 150 milliliters של N NGM buffer, 1.5 milliliters של LB, 150 microliters של 1 molar כולסטרול ו-75 microliters של 100 milligrams per milliliter Streptomycin. הוספת ה-LB מסייעת במניעת הידבקות התולעים לזכוכית ולפלסטיק, אך כמות זו אינה מספיקה כדי לתמוך בצמיחת חיידקים.

סננו את התערובת כדי לעקר אותה, לאחר מכן העבירו אותה לבקבוק מעוקר בנפח של ליטר אחד והניחו לבקבוק בצד כדי לאפשר את שחרור הביצים מהתולעים הבוגרות של GR. שטפו את החיידקים מהתולעים על ידי סבוב בצנטריפוגה והחלפה של מצע ה-NGM עד שהנוזל העליון (supernatant) יהיה צלול. שטפו את התולעים פעם שנייה על ידי השעיה במים סטריליים וסבוב נוסף בצנטריפוגה לאחר הסבוב.

הסיר את העלון ומלא את המבחנה ב-3.75 milliliters של מים סטריליים. הוסף מיליליטר אחד של אקונומיקה ביתית ו-250 microliters של sodium hydroxide בריכוז 10 normal, וערבב מיד על ידי הפיכת המבחנה חמש עד שש פעמים. הנח את המבחנה ברוטטור לאחר שהתולעים נחשפו לאקונומיקה למשך ארבע דקות.

הנח את הפשורה תחת מיקרוסקופ סטריאו. רוב הבוגרים אמורים להיות מלוייים. נער את הפשורה בעוצמה 15 עד 20 פעמים כדי לסייע בליס של תולעים בוגרות שנותרו; לאחר שהליס נמשך חמש דקות בסך הכל, הוסף מים סטריליים עד למילוי הפשורה.

ערבבו על ידי הפיכה חמש עד שש פעמים כדי לאסוף את הביצים. סובבו את המבחנה בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-500 RCF. שטפו את הביצים שלוש פעמים על ידי השהיה (Resus), ערבוב ב-10 milliliters של מים סטריליים, סבוב בצנטריפוגה והסרה של הנוזל העליון.

בשלב הבא, דללו מדגם של 100 µL של הביצים בדילול של 100 פעמים על ידי הוספה של 10 mL של בופר NGM. לאחר מכן, העבירו בעזרת פיפט שלוש מנות של 5 µL כל אחת על מכסה של צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ. ספרו את מספר הביצים בשלוש מנות נפרדות של 5 µL.

להערכת מספר הביצים הכולל, הוסיפו 200,000 עד 2 מיליון ביצים לבקבוק המכיל NGM buffer ונערה את התרבית במהירות של 100 RPM בטמפרטורה של 20 degrees Celsius. לפחות 16 שעות לאחר הוספת הביצים לבקבוק, השתמשו בפיפט סרולוגי סטרילי כדי להוציא כ-0.5 milliliters מתרבית התולעים התלויה.

טפטפו באמצעות פיפט שלוש טיפות של 5 µL על המכסה הסטרילי של צלחת פטרי. הניחו את המכסה במקפיא של 20°C- למשך דקה עד שתי דקות כדי לשתק את התולעים. לאחר שהתולעים שותקו, ספרו באמצעות מיקרוסקופ סטריאו את מספר התולעים החיות שבקעו בממוצע ל-5 µL כדי להעריך את המספר הכולל.

הפשיר את תרבית חיידקי ה-OP 50 הקפואה שהוכנה קודם לכן על ידי הנחתה על השולחן למשך מספר דקות. לאחר מכן, הוסף שלושה מיליליטר של 50% OP 50 לכל 500,000 תולעים שבקעו. נער את הבקבוק ב-100 RPM בטמפרטורה של 20 °C.

התולעים יתפתחו ללרוה L4 ולשלבים של בוגרים צעירים תוך כ-51 שעות. יש לנטר את כמות הבקטריות לאורך כל תקופת הדגירה באמצעות בדיקה ויזואלית. יש להוסיף בקטריות אם המצע הופך לשקוף.

השתמשו בפיפטה סרולוגית סטרילית כדי להעביר כ-0.5 milliliters של תרבית התולעים התלויה לצלחת אגר NGM סטנדרטית. בחנו את התולעים תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לוודא שמרביתן הן לרוות שלב L4 ומבוגרים צעירים; תחת מיקרוסקופיה בשדה בהיר (brightfield microscopy), ללרוות שלב L4 תהיה נקודה שקופה ונטרלית במרכז הגוף. מבוגרים צעירים יהיו מעט גדולים יותר ולא תהיה להם נקודה שקופה.

בשלב הבא, העבירו את תרבית התולעים למבחנות סטריליות בנפח 50 מילילטר. הניחו את המבחנות במעמד למבחנות בתוך המנדף ואפשרו לביצים שלא בקעו או לתולעים שלא התפתחו לשקוע. אלו שוקעים לאט יותר מתולעים מפותחות.

לאחר 10 דקות, הסירו את הנוזל העליון, המכיל תולעים שלא בקעו ולא התפתחו, באמצעות שאיבה. הוסיפו כ-10 milliliters של NGM buffer לכל משקע ותלו את התולעים על ידי סיבוב עדין של המבחנות. אספו את כל התולעים למבחנה אחת בנפח 50 milliliter. סובבו בצנטריפוגה עם סלסלה נתיבה (swinging bucket centrifuge) ב-500 RCF למשך 30 שניות.

לאחר מכן, השהו מחדש את התולעים ב-50 מיליליטר של NGM עם 1% lb כדי לשטוף אותן. חזרו על פעולה זו, שטפו שלוש עד ארבע פעמים כדי להסיר את החיידקים לאחר השטיפה. מלאו את המבחנה בבופר NGM פלוס LB עד לנפח של 50 מיליליטר.

שפכו זאת לתוך בקבוק חלוקה לתולעים בעיצוב מיוחד עם מגנט שכיול והניחו אותו על פלטת שכיול. נדרש נפח מינימלי של כ-20 milliliters או 60,000 תולעים כדי למלא את החלל המת בבקבוק החלוקה ובקסטת החלוקה. ספרו את מספר התולעים בשלוש טיפות של 5 µL כפי שהודגם בעבר.

לאחר ספירה ב-NGM פלוס LB עד לריכוז של 12 עד 15 תולעים לטיפה של 5 µL, כל פלטת 84 בארות דורשת כ-35,000 תולעים או 11.5 mL של תולעים תלויות. טענו קסטת חלוקה של 10 µL למחלק ועקרו אותה על ידי הזרמה של 70% ethanol. שטפו את ה-ethanol על ידי הזרמה של מים סטריליים.

הכנס את קצה קסית החלוקה לתוך הבקבוק כך שתהיה מעט מעל מוט הבחישה מבלי להפריע לתנועתו. ודא שהתולעים נשארות תלויות לאורך כל נפח הבקבוק. תכנת את מחלק התמיסות לחלוקת תולעים במהירות נמוכה עם שני פולסי הכנה (pre pulses) להפעלה, והזרק לפחות 10 milliliters של תרחיף תולעים.

מלאו את פלטות המיקרוטיטר, שכבר צריכות להכיל את תרכובות הבדיקה, במהירות כדי למנוע מהתולעים לשקוע בתוך הצינוריות. בשלב זה יש להוסיף את תרכובת הבדיקה שהועמסה מראש על פלטת המיקרוטיטר. Glow. אטמו את הפלטות בסרט דביק נשמי כדי למנוע הצטברות אבק בבארות.

הניחו את הפלטות על פלטפורמת ניעור בתוך אינקובטור בטמפרטורה המתאימה לבדיקה. אין לערום את הפלטות, שכן הדבר עלול להגביל את זרימת האוויר. הכניסו את פלטת המטרה לקורא מיקרופלטות כדי למדוד את עוצמת הפלורסצנציה של כל באר באורכי גל פליטה ועירור מתאימים.

המסננים ששימשו עבור GFP הם עירור ב-485 ופליטה ב-528. המסננים עבור RFP הם עירור ב-540 ופליטה ב-590. לאחר קריאת הפלטה, חשב את היחס בין GFP ל-RFP ונרמל את התוצאות באמצעות הקריאות מהבארות של הביקורת, שאינן מכילות את התרכובת המפעילה, כדי לקבוע את ההבדל המדויק במכפלה (fold difference) של עוצמת הפלואורסצנציה הנובעת מטיפולים בודדים.

בדיגת ה-SSKN המוצגת כאן משתמשת בדוח כפול המשולב כרומוזומית, זן שבו נספרו התולעים באופן ידני באמצעות מיקרוסקופ סטריאו. מספר התולעים נמצא במתאם עם הנפח שהועבר עם ערך R squared של 0.94 וערך p של פחות מ-0.0001. דבר זה מעיד על כך שניתן לשלוט במספר התולעים המועבר לכל באר באמצעות התאמת הנפח המועבר.

פלואורסצנציית ה-GFP הכוללת לכל באר המוצגת משמאל ופלואורסצנציית ה-RFP לכל באר המוצגת מימין הן בעלות הדירות גבוהה בין באר לבאר בלוח של 384 באערים בדמויות אלו. סימני XS מציינים את הפלואורסצנציה היחסית שנמדדה בכל באר. קווים רצופים מציינים את הממוצעים וקווים מקווקווים מציינים שלוש סטיית תקן מעל או מתחת לממוצע הפלואורסצנציה של כל הבאערים, עם מקדם וריאציה נמוך מ-9%. כפי שמוצג בדמות זו, פלואורסצנציית GFP מהפרומוטור GST 4 נמצאת במתאם ליניארי עם פלואורסצנציית RFP מהפרומוטור DOP 3 על פני 384 באערים, עם ערך R squared של 0.62 וערך p נמוך מ-0.0001.

לפיכך, ניתן להשתמש במדווח RFP שאינו בר-השראה כדי לנרמל את מדווח GFP בר-ההשראה. כאשר מדווח זה מתבטא, היחס בין פלואורסצנציית GFP לפלואורסצנציית RFP הופך לדליאביליטי גבוהה מאוד בין באר לבאר בלוח של 384 בארות.

חישוב היחס בין GFP ל-RFP הפחית את מקדם השונות לפחות מ-6%, מה שמדגים את היכולת של הדו-פרומוטור RFP reporter להפחית שונות, כפי שמוצג כאן. ההשראה של GFP ביחס ל-RFP באמצעות חומר זנוביוטי המפעיל את SK N one היא חסונה ובעלת הדירות גבוהה על פני לוח 384 בארות; יחסי הפלואורסצנציה היחסיים הממוצעים של כל בארות הביקורת ובארות ה-due GLO מסומנים בקוים רציפים. שלוש סטיות תקן מעל ממוצע הביקורת ומתחת לממוצע ה-dlo מסומנות בקוים מקווקווים.

לאחר רכישת המיומנות, ניתן להקים תרבית תולעים תוך כשעה ביום הראשון, ופעולות האיסוף והחלוקה של התולעים יכולים להיעשות תוך כשעתיים אם הן מבוצעות כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להתחיל עם לפחות 60,000 תולעים ולהשריות אותן בזמן החלוקה. בעקבות פרוצדורה זו, ניתן לבצע סריקות אחרות, למשל, רכובים עבור מסלולים הקישוריים (inducible pathways) אחרים, במטרה לפתח מודולטורים למסלולים אחרים לאחר פיתוחה.

טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחומי הסריקה בספיקה גבוהה (high throughput screening) ובחיישנים ביולוגיים לזיהוי מהיר של מודולטורים של מסלולים באמצעות מולקולות קטנות או לגילוי מזהמים סביבתיים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להכין תרביות, להעביר ולמדוד זני *elegans* פלואורסצנטיים לצורך סריקה בספיקה גבוהה של מסלולי שחבור הניתנים להשראה, או לבדיקת דגימות מרובות לאיתור מזהמים סביבתיים.