שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשיג מספר תרביות של מקרופאגים מתרביות ראשוניות מעורבות של תאי כבד של חולדה, ללא צורך בציוד מורכב או במיומנויות מיוחדות. מטרה זו מושגת תחילה באמצעות דיסוציאציה של תאי כבד של חולדה בוגרת על ידי פרפוזיה של קולגנאז, ולאחריה בידוד של פראקציית תאי ההפטוציטים הפארנכימליים. לאחר מכן, התאים מדגריים בבקבוק תרבית רקמה מסוג T 75 עם מצע גידול כדי להקים תרביות ראשוניות מעורבות של תאי כבד.

לאחר 10 עד 12 ימים של תרבית, את בקבוקי התרבית מנערים כדי להקל על העברת המקרופאגים לצלחות פלסטיק, מהן הם מופקים על ידי היצמדות סלקטיבית לאחר תקופת דגירה קצרה. לבסוף, ניתן להפיק יותר מ-10 של שש התאים באופן חוזר מאותם בקבוקי תרבית רקמות T 75 במרווחים של יומיים עד שלושה ימים למשך יותר משבועיים. שיטות בידוד למקרופאגים של הכבד תוארו היטב.

עם זאת, רוב השיטות הקודמות דורשות ציוד מתוחכם, כגון סרטור פריגלי (centrifugal illustrator), ומיומנויות טכניות גבוהות. כאן אנו מציגים שיטות פשוטות וחדשניות להשגת מקרופאגים של הכבד במספר ובטוהר מספיקים מתרביות ראשוניות מעורבות של תאי כבד עטופים של בוגרים, שאינן דורשות ציוד מיוחד או מיומנויות מעבדה מתקדמות. נתיחה של בעלי חיים, פרפוזיה של הכבד והכנת תאים יודגמו על ידי הדוקטורים Norco, Yamanaka ו-Miko yoshioka במכון הלאומי לבריאות בעלי חיים.

כעת ידגימו ד"ר טקטו טקנו מהמכון הלאומי למדעי האגרו-ביולוגיה את בידודם וטיהורם של מקרופאגים מהכבד מדגימות תרבית. בואו נתחיל. כדי להתכונן לפרפוזיה של כבד חולדה, התחילו בחימום מוקדם של בקבוק אחד של תמיסת שטיפה ובקבוק אחד של תמיסת קולגנאז.

לאחר אישור הסדציה באמצעות צביטה בעור, הניחו חולדה זכר בוגרת מורדמת במגש נירוק חלודה ורססו את הבטן והחזה שלה ב-70% ethanol. לאחר מכן, בצעו חתך קטן במרכז הבטן באמצעות מספרי דיסקציה וקלפו את העור לאחור. פתחו את הבטן בעזרת המספריים ואשרו את מיקומו של הווריד השער (portal vein).

בשלב הבא, העבירו את חוט התפירה הכירורגי מתחת לווריד השער (portal vein) והדקו את החוט באופן רפוי. לאחר מכן, סגרו את החלק הדיסטלי של הווריד החלול התחתון (inferior vena cava) ואת ווריד הגריסה (mesenteric vein) באמצעות תפס Mosquito כדי למנוע רפלקס של דם אל הכבד. פתחו את חלל בית החזה על ידי גזירת הסרעפת במספריים וחשפו את הלב; לאחר ביצוע חתך קטן בווריד השער באמצעות מספרי עיניים (ophthalmic scissors), הכניסו לווריד קטטר פלסטיק בקוטר 2 mm והדקו את החוט בחוזקה סביב הקטטר.

טענו מערכת פרפוזיה בתמיסת השטיפה שחוממה מראש ולאחר מכן חברו אותה לקטטר. התחילו בפרפוזיה ב-C two בקצב של 10 milliliters per minute. במקביל, בצעו חתך בדופן העלייה הימנית באמצעות מספרי דיסקציה.

המשיכו בפרפוזיה במשך 10 דקות, ולאחר מכן החליפו את תמיסת הפרפוזיה בתמיסת קולגנאז (collagenase) ובצעו פרפוזיה למשך 10 עד 20 דקות. קצבו 25 מיליליטר של תמיסת קולגנאז לתוך כלי ביקר סטרילי, בקצב של 10 מיליליטר לדקה. לאחר מכן, הוציאו את הכבד שעבר פרפוזיה והניחו אותו בזהירות בתוך הכלי.

קצצו את הכבד לחתיכות קטנות באמצעות מספריים. הוסיפו 75 milliliters של MEM קר לתרחיף התאים שהתקבל. לאחר פיפטור עדין, סננו את התרחיף דרך מסנן תאים של 100 micrometer.

כדי להסיר את רקמת החיבור מרגמנטי הרקמה שלא התעכלו, אספו את התסנין למבחנות קוניות של 50 מיליליטר. העבירו את התסנין למבחנות קוניות של 50 מיליליטר ושטפו את התאים ארבע פעמים על ידי סבב ראשון של התאים ב-50 Gs למשך דקה אחת בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כאשר הסבב נעצר, השליכו בזהירות את העילוי ולאחר מכן השעה מחדש את המשקע ב-MEM קר, ובצעו סבב נוסף של התאים לאחר השטיפה האחרונה.

שחזר את תאי הכבד בתוך מצע גידול. כעת, זרע את התאים בחמישה עד 10 בקבוקי תרבית רקמה T 75 בצפיפות של 6.7 times 10 to the fourth תאים לסמ"ר. הנח את בקבוקי התרבית באינקובטור והחלף את מצע הגידול מדי יומיים עד שלושה ימים.

לאחר יום אחד של תרבית, hepatocyites פ 사용할 פרינכימליים מתפשטים על פני השטח של הבקבוק ומראים מורפולוגיה פוליגונלית טיפוסית דמוית אבן קופאל עם גרעין עגול אחד או שניים. תוך מספר ימי תרבית, ה-hepatocytes הפרינכימליים מאבדים את המורפולוגיה של תאי אפיתל והופכים לתאים פיברובלסטיים שטוחים יותר. סביב היום השישי, תאים עגולים ובהירים דמויי מקרופאגים מתחילים להתרבות על גבי השכבה של התאים הפיברובלסטיים בניגוד פאזה. הצמיחה של התאים הדמויי מקרופאגים מגיעה לשיאה סביב היום ה-12.

מספר התאים הדמויי מקרופאגים פוחת סביב היום ה-19, כאשר שכבת תאי הפיברובלסטים מתחילה להתנוון. לפיכך, לאחר כ-7 עד 10 ימי תרבית, אנו תולה את המקרופאגים שהתרבו על שכבת התאים בתוך תווך התרבית, על ידי ניעור הדדי של בקבוקי התרבית למשך 30 דקות לאחר שביצעו את התלייה מחדש של המקרופאגים. מלאו כל אחת מהצלחות הפלסטיק בגודל 100 מילימטר שאינן בדרגת תרבית רקמה בתווך משני בקבוקי T 75.

מלאו מחדש את בקבוקי התרבית במצע גידול והחזירו אותם לאינקובטור. דגרו את הצלחות הפלסטיק למשך 30 דקות לאחר תקופת הדגירה, שטפו את הצלחות שלוש פעמים על ידי שאיבת המצע ושטיפה עדינה של צלחת הפלסטיק ב-PBS כפי שניתן לראות כאן; כבר לאחר 10 דקות מהזריעה, תאי מקרופאג נצמדים למשטח הצלחת בעוד שתאי פיברובלסטים מזוהמים אחרים נותרים תלויים. לאחר השטיפה ב-PBS, מתקבלת אוכלוסיית מקרופאגים בדרגת ניקיון גבוהה.

כפי שניתן לראות בדמות זו, התאים מקבלים מורפולוגיה אופיינית למקרופאגים לאחר 40 דקות של תרבית, ותאים במצב מיטוטי נצפים לעיתים קרובות, כפי שמסומן על ידי החצים. כדי לאסוף אוכלוסיית מקרופאגים חדשה ומזוהה זו בדרגת טהרה גבוהה, יש להוסיף מיליליטר אחד של תמיסת trip LE Express לתאים השטופים ולהחזיר את הצלחות למדגרה ל-10 דקות נוספות. לאחר תקופת דגירה זו, יש להוסיף תשעה מיליליטרים של מצע גידול, ואז לגרד בעדינות את המקרופאגים ההדבוקים בעזרת גורד תאים (cell scraper), להעביר לשפופרת צנטריפוגה קונית של 15 מיליליטר, לסובב בצנטריפוגה ולהסיר את supernatant.

הוסיפו מיליליטר אחד של מצע גידול, פרקו את גושי התאים המושעים לתאים בודדים באמצעות פיפוט נמרץ, וספרו את מספר התאים באמצעות המוציטומטר כפי שמוצג בגרף זה; ניתן לאסוף יותר מ-10⁶ תאים מבקבוק תרבית T 75 באופן חוזר במרווחים של יומיים עד שלושה ימים במשך יותר משבועיים, מה שמאפשר תנובת תאים כוללת של 10⁷ לבקבוק תרבית T 75. כפי שמוצג בתמונות אלו, התאים המבודדים נצבעו אימונו-היסטוכימית עם נוגדנים מונוקלונליים נגד אנטיגנים של מקרופאגים של חולדה כגון CD 68 או ED 1 ו-CD 172 A או OX 41. תאים אלו הפגינו תכונות תפקודיות של מקרופאגים, כגון פגוציטוזה פעילה של מיקרו-חרוזיים המסומנים ב-FITC.

בסרטון זה, הצגנו שיטה פשוטה ויעילה להשגת מקרופאגים מתרביות ראשוניות מעורבבות של תאי כבד אדומים בוגרים. הפרוצדורה שלנו אינה דורשת ציוד או מיומנויות מורכבות, אך מספקת מספרים מספיקים של מקרופאגים טהורים שניתן לאסוף באופן חוזר מאותה תרבית של נחושת. ניתן להחיל שיטה זו גם על מיני יונקים אחרים.

תודה שצפיתם בסרטון ובהצלחה בניסוייכם העתידיים. בהצלחה.