קביעת מבנים מולקולריים של גליקופרוטאינים HIV מעטפה באמצעות אלקטרונים cryo-טומוגרפיה ו ממוצעים אוטומטי תת tomogram

מעל ל-60 מיליון אנשים הודבקו ב-HIV, הווירוס הגורם לאיידס. HIV-AIDS הוא משבר בריאותי עולמי, ואף על פי שמאמצי מחקר אינטנסיביים האריכו באופן דרמטי את חייהם של אנשים נגועים, חיסון אמיתי נותר חסר. מוקד מרכזי במחקר על חיסון ל-HIV הוא הגליקופרוטאין של המעטפת, שבו משתמש ה-HIV כדי לחדור לתאי מטרה.

בסרטון זה, אנו מדגימים כיצד אנו מקבלים מבנים של חלבון חשוב זה באמצעות טכניקת הדמיה הנקראת קריו-טומוגרפיה אלקטרונית. החל מ-HIV מטהר, אנו מציגים את השלבים בהכנת דגימות קפואות, שלבים בהקלטת תמונות במיקרוסקופ אלקטרונים מדגימות קפואות אלו, ושלבים בהמרת תמונות אלו למודלים מבניים שעשויים להועיל לתכנון חיסון נגד hiv aids. היבט ייחודי של מה שאנו מציגים בסרטון זה הוא שהעבודה תודגם על ידי חברי המעבדה שלה, המקיפים טווח רחב של גילאים, מתלמידי חטיבת ביניים ותיכון ועד סטודנטים לתואר ראשון ותואר מתקדם, ועד לפוסט-דוקטורנטים ומדענים בכירים.

הכנת דגימות נגיפים מזוכגים (vitrified) המתאימות לטומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית מתבצעת על ידי פריסת תרחיף מימי של נגיפים על פני חורים קטנים בסרט פחמן הנתמך על ידי רשת נחושת, ולאחר מכן הקפאה מהירה של הנגיפים. מטרת שלב זה היא להכין דגימה קפואה של נגיפים שלמים שנלכדו במצב קרוב למצבם הטבעי. לתחילת התהליך, הרשתות מוכנסות ליחידת פריקה זוהרת (glow discharge).

מכשיר זה מנקה את הרשתות על ידי חשיפתן לגז מיונן. כעת, כאשר הרשתות מוכנות לשימוש, מכינים תמיחה של וירוסים המעורבבים עם חלקיקי זהב קטנים. חלקיקים אלו חיוניים לאיסוף הנתונים ולעיבודם.

בשלב הבא, טיפה של תמיסות נגיפים מונחת על רשת שעברה ניקוי פלסמה טרי. הרשת נטענת לאחר מכן לתוך רובוט, אשר סופג ממנה נוזלים באמצעות נייר סינון, ובכך מצמצם את הטיפה לשכבה דקה של נוזל. לאחר מכן, הדגימה טובעת לתוך אתאן נוזלי, המקפיא את הנגיפים במהירות העולה על 100,000 kelvin לשנייה.

את הרשת שהוקפאה בשיטת ה-plunge מעבירים לאחר מכן לקופסת אחסון לצורך הובלה למיקרוסקופ. פעולה זו חוזרת על עצמה עד להקפאת מספר הרשתות הרצוי. כעת, לאחר שרשתות דגימות הווירוס מוכנות, השלב הבא הוא להטעין אותן לתוך המיקרוסקופ.

עבור הדימות, ניתן לבצע זאת ידנית או בעזרת סיוע רובוטי. כאשר רשתות הדגימה נטענות ידנית, המשתמש יושב בתחנה ייעודית שבה ניתן לתפעל את הדגימות תחת חנקן נוזלי; הדגימות מוכנסות לתא נייד מקורר בחנקן הנאטם, מרוקן מאוויר, ולאחר מכן מחובר למיקרוסקופ. מיקרוסקופים חדישים יותר מסוגלים לטעינה אוטומטית יותר של הדגימות.

כאן, במיקרוסקופ Titan Cryos, דגימות קפואות מועברות למיקרוסקופ על ידי המשתמש ולאחר מכן נטענות באופן רובוטי יחד עם רשתות הדגימה בתוך המיקרוסקופ. המשתמש יכול לבחון כל רשת לפני תחילת הדמיה. פרמטרי המיקרוסקופ נקבעים עבור כל אזור ברשת הדגימה הכולל מאפיינים בעלי עניין.

במקרה זה, המאפיינים הם נגיפי HIV. עם הגדרת כל אזור חדש, מחשב המיקרוסקופ שומר את פרמטרי ההדמיה הספציפיים לאותו אזור. כאשר המשתמש מגדיר את כל המיקומים הרלוונטיים, המחשב חוזר באופן אוטומטי לכל מיקום ואוסף מערך נתונים.

כל מערך נתונים נאסף על ידי הטיית רשת הדגימה ביחס לאלומה האלקטרונית, תוך הבטחה שהאלומה תישאר ממוקדת באותה נקודה על הרשת. איסוף נתונים במיקרוסקופיה אלקטרונית דרש באופן מסורתי מהמשתמשים לשבת ליד המיקרוסקופ ולפעול פיזית עם הציוד. סגנון זה של אינטראקציה עם המיקרוסקופ מוצג כאן במהלך ביקורו של הנשיא אובמה במפעל של אינטל.

התקדמויות אחרונות בממשקי מחשב של מיקרוסקופים מאפשרות כיום למשתמשים לנטר ולהתאים את איסוף הנתונים בזמן אמת ממחשב מרוחק במעבדה או במקום אחר. כדי להדמיא את הצורות של המעטפת ושל קוצי הגליקופרוטאין, יש לבצע ממוצע של המידע ממאות תמונות בודדות כדי להגביר את האות. זהו תהליך עתיר משאבים חישוביים, אשר מבוצע כאן באמצעות צביר מחשבים הנקרא Bio Wolf.

ב-NIH פותחו שיטות רב-עצמתיות למיצוי נפחים בודדים ולמיצוע המידע באמצעות אלגוריתמים המסוגלים לפעול ברמות רעש גבוהות. כחלק מהמהות של סוג זה של נתונים, מפות הצפיפות שהתקבלו הן מנגיפים טבעיים והן מנגיפים המקומפלקסים עם מולקולות בעלות חשיבות ביולוגית, מספקות מאגר מידע עשיר על הביולוגיה המבנית של HIV. מפות הצפיפות מקבלות חיים ברמה של פירוט מולקולרי כאשר הנתונים משולבים עם מידע מקריסטלוגרפיית קרני X של תת-היחידות הבודדות המרכיבות את דוד ה-envelope glycoprotein.

נתונים המתקבלים מטומוגרפיות אלו יכולים להיות דחוסים מאוד ומאתגרים לפירוש. ניתן להשתמש בתוכנות תלת-ממד עבור תעשיית הבידור כדי להציג את המודלים התלת-ממדיים על ידי הוספת צבעים, טקסטורות ותאורה, ובכך להקל על ניתוחם. תוכנות ויזואליזציה נפוצות כוללות את Mirror 3D Studio Max ו-Maya.

הרגע הדגמנו פרוצדורות שלב-אחר-שלב כיצד ניתן להשיג מודלים מולקולריים של מבנה הגליקופרוטאין של המעטפת, החל מ-HIV מופק. באמצעות שיטה זו, קבענו גם מבנים של הגליקופרוטאין של המעטפת בקומפלקס עם מגוון מולקולות שיכולות להיקשר לו ולנצל את הנגיף.

כאן אנו מציגים דוגמה למבנה של הגליקופרוטאין של המעטפת במתחם עם נוגדן הנקרא B12. הבנת הסיבה לכך שחלק מהמולקולות יכולות להיקשר לנגיף ולנצל אותו בעוד שאחרות אינן יכולות, חשובה מאוד לתכנון רציונלי של חיסונים. קביעת המבנים המולקולריים של גליקופרוטאיני מעטפת מ-HIV או מנגיפים אחרים, כגון שפעת ואבולה, היא המפתח להבנת הכניסה של הנגיף והניצול שלו.

כפי שראיתם, טומוגרפיה אלקטרונית קריוגנית מתגלה כעת ככלי רב עוצמה להשגת מטרה זו.