זיהוי וניתוח של אבות עכבר Erythroid באמצעות CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות תאי קדם של כדוריות דם אדומות ישירות ברקמה שנקטפה זה עתה מעכברים. הדבר מאפשר לנו לחקור את תכונותיהם המולקולריות בזמן שהמערכת האריתרופואטית בעכברים אלו עוברת שינוי. לדוגמה, במהלך ההתפתחות העוברית או במהלך התגובה למעקה היפוקסי, תחילה מבודל רקמה המטופואטית מכבד עוברי של עכבר, או מטחול או ממח עצם של עכבר בוגר, ומופרדת לתיתה של תמיסת תאים בודדים.

בשלב הבא מסמנים את התאים באמצעות נוגדנים נגד סמני פני השטח של התא CD 71 ו-TER 19, וכן עם כל סמן אחר הרלוונטי למחקר, למשל, למדידת הישרדות תאים או מצב מחזור התא. ת сусפנזיית התאים המסומנת מנותחת לאחר מכן באמצעות מנתח פלוו ציטומטריה (flow cytometry analyzer), ומזוהים תתי-אוכלוסיות ספציפיות של אריתרובלאסטים בשלבי הבשלה שונים. ניתן לטהר תתי-אוכלוסיות ספציפיות אלו באמצעות מיון תאים (cell sorting). לאחר מכן, ניתן לבצע ניתוח תאי ומולקולרי עבור כל תת-אוכלוסייה של הבשלת אריתרובלאסטים.

היכולת לזהות אריתרובלסטים בשלבי הבשלה ספציפיים ישירות ברקמות המטופואטיות שבודדו acabado, מעניקה לנו את ההזדמנות לחקור את התאים בקליפה הפיזיולוגית. שיטה זו מאפשרת לנו, לפיכך, לחקור אריתרובלסטים בדרגות הבשלה שונות ותגובתם in vivo. כאשר עכברים נחשפים לגירויים, הם מאיצים את קצב האריתרופואזה.

לדוגמה, תנאי היפוקסיה המדמים גובה רב או הזרקה של ההורמון erythropoietin. אנו משתמשים בציטומטריית זרימה רב-פרמטרית כדי לזהות erythroblasts בתוך סביבת רקמה מורכבת ולבחון בו-זמנית את אותות ההישרדות ומצב מחזור התא שלהם. אנו יכולים גם למיין erythroblasts משלבי הבשלה ספציפיים ישירות מרקמה טרייה ולבחון את רמות ביטוי הגנים, מצב הכרומטין או תפקודים מולקולריים אחרים שלהם.

המארויטרופויזה הסופית בעכבר מתרחשת בטחול ובמחית העצם של העכבר הבוגר. לפיכך, רקמות אלו יוסרו מעכבר שהורדמו. לאחר הרדמת העכבר, יש לשאוב דם באמצעות דקירה של הלב למבחנות איסוף דם המכילות EDTA או הפרין; דם זה ישמש בהמשך לספירת המטוקריט, ספירת רטיקולוציטים או ניתוח CBC.

העבירו את הטחול ואת הירך שנאספו למבחנות נפרדות המכילות cold staining.Buffer. שמרו את הרקמות שנאספו על קרח במידת הצורך. שקלו את הטחול.

עכברים העוברים תגובת עקה אריתרופואטית צפויים להראות עלייה משמעותית במשקל הטחול. לאחר מכן, תאי טחול ותאי מח עצם מוכנים מהרקמות שנאספו באמצעות פרוצדורות שהודגמו בעבר בעובר של עכבר. אריתרופואזה דפיניטיבית מתרחשת בכבד העוברי בין הימים העובריים 12.5 ו-15.5.

עכברות נקבות בהריון עם תזמון ידוע מוכנות להשגת תאי כבד עובריים בימים 12.5 עד 14.5 להריון. העכברות ההמויות והקרניים הרחמיות מוסרות אל תוך צלחת פטרי המכילה קרח. מצע תרבית קר או בופר צביעה.

מיקרוסקופ דיסקציה נדרש לצורך ביצוע דיסקציה של כבד עוברי מיום עוברי 12.5 או מוקדם יותר, כדי להוציא את העוברים מהרחם. תחילה, הפר את כל חרוז (bead) מהקרן. לאחר מכן, הסר בעדינות את דופן הרחם כדי לשחרר את העובר שנמצא בתוך שק השגשוג שלו.

קלפו בעדינות את קרומי השליה. כבד העובר הוא הרקמה הבטנית האדומה הגדולה ביותר, הממוקמת מתחת ללב קטן בהרבה. כדי לבצע דיסקציה לכבד העובר, השתמשו בפינצטה כדי לקבע את העובר משני צדדיו של הכבד ודחפו בעדינות את הכבד אל מחוץ לבטן אל תוך המדיום.

העבירו בעדינות את הכבד לפרועת המכילה תמיסת צביעה טרייה. לאחר שכל כבדי העוברים נשחלו והועברו לפרועת המכילה תמיסת צביעה טרייה, פרקו את הכבדים באופן מכני באמצעות פיפטור, ולאחר מכן סננו את התאים המפורקים דרך רשת ניילון בנחורי 40 מיקרון. שטפו את התאים פעמיים באמצעות סנטריפוגציה, השליכו את העילאי וסספנדו אותם מחדש בתמיסת צביעה.

לאחר השטיפה השנייה, צבע את התאים ב-trypan blue וספור אותם באמצעות המוציטומטר (hemo cytometer). כבד עוברי ב-E 13.5 מכיל כ-10⁷ תאים. השהה מחדש את התאים בריכוז של 1-2 × 10⁶ תאים לדגימה של 200 µL עבור אנליזה בציטומטריה זורמת.

לצורך פרוטוקול וידאו זה, צביעה בנוגדנים עבור ציטומטריה של זרימה תודגם רק על תאי כבד עובריים. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו תערובת מקדימה לצביעה בנוגדן ראשוני המכילה את הרכיבים הבאים: rabbit IgG מופרש לחסימת רספטורי FC בתאי עכבר, CD 71 FETR one 19 PE, ונוגדן המכוון לחלבון פני השטח של התא fast. ערבבו בעדינות את תמיסת הנוגדנים על ידי היפוך השפופרת פעמיים עד שלוש פעמים, הוסיפו 200 µL מהתערובת המקדימה לצביעה בנוגדן ראשוני לדגימת תאי הכבד העוברי שהוכנה מראש, ובצעו פיפטינג עדין למעלה ולמטה כדי לסuspended את התאים.

בשלב הבא, הכינו את שש דגימות התאי-ביקורת הללו. דגימה לא צבועה שבה התאים נשארים בתמיסת הצביעה כדי לספק את האוטופלורסצנציה של רקע התאים, צבע בודד עבור כל נוגדן או צבע המשמשים בפרוטוקול כדי לתקן חפיפה ספקטרלית בין הערוצים, שבניסוי זה הם TUR one 19 PE CD 71 fz fast, biotin ו-streptavidin A PC, ובקרת fluorescence minus one עבור fast biotin, המספקת את הרקע האמיתי עבור אותו ערוץ שבו התאים צבועים בכל הצבעים או הנוגדנים בפרוטוקול למעט fast biotin. הדגירו את הדגימה ואת הביקורות הרלוונטיות בצביעת הנוגדן הראשוני על קרח למשך 45 דקות עד שעה בחשיכה.

בסיום הדגירה, שטפו את התאים על ידי הוספת שלושה מיליליטר של תמיסת צביעה לכל מבחנה וסובבו במערבולת למשך שלוש עד חמש דקות בכ-400 $\times$g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הוסיפו strep avid ב-PC והדגירו את המבחנות על קרח למשך 30 עד 45 דקות. עם סיום הדגירה, שטפו את התאים כפי שבוצע בצביעה של הנוגדן הראשון.

לבסוף, השעו שוב את התאים בתמיסת צבע המכילה את צבע ה-DNA שאינו חודר לתאים, seven a a d, כדי להוצא תאים מתים. הדגימות מוכנות כעת לניתוח בציטומטריה זורמת. ההיבט המאתגר ביותר של הליך זה הוא ניתוח gating נכון של אירועי הציטומטריה הזורמת, המאפשר זיהוי מהימן של תתי-אוכלוסיות של אריתרובלאסטים.

התהליך דורש כיול מדויק של המכשיר, שימוש בכל דגימות הבקרה המתאימות, פיצוי קפדני על חפיפה ספקטרלית וביצוע Gating שולל תאים מתים, אגרגטים ואירועים קטנים מאוד. בתחילת ניתוח הנתונים, נעשה שימוש בדגימה ללא צביעה ובדגימות הבקרה בעלות צבע בודד כדי לקבוע את הפיצוי על החפיפה הספקטרלית עבור כל שילוב צבעים.

בדוגמה זו, נראה כיצד פלואורסצנציה של fit E חודרת לערוץ ה-PE וכיצד חפיפה ספקטרלית זו מתוקנת לאחר פיצוי. ראשית, באמצעות בקרת חסרי הצביעה, נגדיר אזור חיובי ל-fit E ושלילי ל-PE. לאחר מכן, באמצעות בקרת צבע יחיד של fit E, נוכל להמחיש את החדירה הספקטרלית לערוץ ה-PE.

בעקבות פיצוי דיגיטלי באמצעות תוכנת FlowJo, אות ה-spillover fit E בערוץ ה-PE מומעט. לאחר הפיצוי, ניתן להסיר תאים מתים, אגרגטים ואירועים קטנים. אגרגטים ודובלטים של תאים מוסרים על ידי שרטוט גובה הפיזור קדימה (forward scatter height) מול שטח הפיזור קדימה (forward scatter area) ובחירת אירועים בתוך שער דיאגונלי צר.

תאים מתים מוסרים על ידי בחירת תאים שליליים לצבע DAPI, צבע DNA שאינו חודר לתא. שער התאים החיוניים השליליים ל-DAPI מוצא גם אירועים קטנים מאוד, כגון גרעינים או פסולת, בעלי פיזור קדימה (forward scatter) נמוך מאוד. לאחר מכן, נציג את אסטרטגיית השערים עבור תאי כבד עוברי.

תאים שנקצרו טריים סומנו עבור CD 71 TUR one 19, ותערובת של נוגדנים המסומנים ב-ZI המכוונים לסמני שושלת שאינם אריתרואידיים. בדוגמה זו, הדגימות כבר עברו פיצוי עבור חפיפה ספקטרלית ולאחר מכן נגזרו כדי להוציא אגרגטים, תאים מתים ואירועים קטנים מאוד. אנו משתמשים בדגימת ה-FMO המכילה את כל הצבעים למעט צביעת ה-fitzy חיובית לשושלת כדי לשרטט היסטוגרמת fitzy ולהגדיר את שער התאים השליליים לשושלת; לאחר מכן אנו מחילים שער זה על דגימת תאי כבד עוברי שצבעה עם סמני שושלת מצומדים ל-ZI.

תאים שליליים לסמני שושלת (Lineage negative) נבחרים וממופות כאשר CD 71 מופיע על ציר ה-Y ו-TER one 19 על ציר ה-X. כעת התאים מוכנים לחלוקה לתתי-אוכלוסיות S zero עד S five. תת-האוכלוסייה S zero מנוקזת לסממני שושלת (Lin depleted) ומכילה במידה רבה תאים בעלי פוטנציאל CFUE לפני תחילת התלות ב-EPO.

תת-אוכלוסיית S one מכילה תאי CFUE תלויים ב-EPO הנמצאים ברובם בשלב S של מחזור התא. תאים בתת-אוכלוסיית S two איבדו את הפוטנציאל ליצירת מושבות ומתחילים להביע המוגלובין. תאי תת-אוכלוסיית S3 הם ברובם Erythroblasts בסיליפילים. תת-אוכלוסיות S four ו-S five מכילות אריתרובלסטים מאוחרים. מוצגת כאן אסטרטגיית הניתוח לאחר רכישת נתונים מתאי טחול שעובדו וסומנו בנוגדנים המכוונים ל-CD 71 ו-TER one 19, וכן היסטוגרמה של קולטן המוות fast.

הראשון מציג את כל האירועים שנרכשו, כאשר השער האלכסוני מייצג אירועים שסבירות גבוהה שהם תאים בודדים, תוך החרגת דאבלטים או צברים גדולים יותר. תאים בשער זה מנותחים בהמשך בהיסטוגרמה השנייה כאן. אירועים קטנים מאוד, שסבירות גבוהה שהם גרעינים או פסולת, מוחרגים.

התאים שעברו סינון מוצגים בהיסטוגרמה שלוש, שבה תאים חיוביים ל-DAPI, שהם ככל הנראה תאים אפופטוטיים עם ממברנה חדירה, הוצאו מהניתוח המשך. היסטוגרמה ארבע מראה את האוכלוסייה המתresulting של תאי טחול חיוניים. ה-pro eGate מכיל תאים עם CD 71 גבוה ו-TER 1.19 בינוני; תאים עם TER 1.19 גבוה מנותחים בהמשך בהיסטוגרמה חמש.

כאן, תאים עם ביטוי גבוה של CD 71 מחולקים לתתי-קבוצות של תאי אריתרובלאסטים פחות בוגרים בעלי שטח פנים גדול, אריתרובלאסטים מסוג A, ואריתרובلاستים קטנים ובוגרים יותר מסוג B. תת-הקבוצה של האריתרובלאסטים הבוגרים ביותר היא ARI C. ניתן למדוד בו-זמנית את הביטוי של חלבוני פני השטח של התאים עבור כל אחת מתתי-קבוצות אלו על ידי הוספת הנוגדנים הרלוונטיים יחד עם TER R one 19 ו-CD 71. היסטוגרמת הצביעה 6 מראה את ביטוי פני השטח של קולטן המוות Fas, באופן ספציפי בתת-קבוצה A בעכברים במצב בסיסי ובעכברים שהוזרק להם מנה בודדת של E ppo.

התוצאות מעידות על כך ש-EPO מדכא ביטוי מהיר באזור. ניתן למדוד בנוסף ביטוי in vivo של חלבונים תוך-תאיים או את מצב מחזור התא עבור תאים בכל תת-קבוצה. בניתוח מייצג זה של מחזור התא, עכברים קיבלו הזרקה תוך-בטנית של BRDU, ומוח העצם נאסף 30 עד 60 דקות לאחר מכן.

בנוסף לצביעה עבור CD 71 ו-TER one 19, התאים נצבעו להטמעה של BRDU ב-D-N-A המשכפל שלהם; תאים חיוביים ל-B-R-D-U נמצאים בשלב S של המחזור. תאי אינטרפאזה הם שליליים ל-BRDU וניתן להבחין ביניהם בשלבי G one או G two M. באמצעות DNAD שבע A A D ניתן למיין תאים מכל אחת מהתתי-קבוצות PRO E area A A B ו-A EC.

כאן הם מוצגים בדגימות ציטוספין המראות הבשלה עקיפה עם גודל תאים קטן יותר, קונדנסציה גרעינית ועלייה בצבע חום המשקפת ביטוי של hemoglobin. לבסוף, מוצג כאן ניתוח מחזור תאים מייצג של תת-האוכלוסייה S3 בכבד עוברי ביום E 13.5. עכברות בהריון הוזנקו ב-BRDU.

כבדים עובריים נאספו, ובין 30 ל-60 דקות לאחר מכן קובעו, חודרו ונצבעו בנוגדנים נגד CD 71, TER one 19 ו-BRDU. מצב מחזור התא של תאי S3 נותח, כאשר תאי פאזה S הם חיוביים ל-BRDU, ותוכן ה-DNA נמדד כמותית על ידי צביעה בצבע ה-DNA seven A a d.

הגישה הציטומטרית המתוארת מאפשרת חקירה בו-זמנית של תפקודים תאיים, כגון ביטוי של סמני שטח התא וחלבונים אחרים, הישרדות תאים, אותיות תאיות באמצעות נוגדנים ספציפיים וסטטוס מחזור התא. לפיכך, היא מאפשרת לנו לחקור את התגובות המולקולריות של אריתרובלסטים, שלב התבגרות שונה, למגוון רחב של גירוים או את השפעתן של מוטציות גנטיות. יש לציין כי תתי-אוכלוסיות ההבשלה בציטומטריה זורמת מוגדרות במונחים של ביטוי סמני שטח התא ופיזור קדמי (forward scatter).

מצאנו כי באופן כללי, תאים בכל תת-קבוצה תואמים לשלב מורפולוגי דומה של אריתרובלאסט במגוון רחב של מודלים של עכברים. עם זאת, אנו ממליצים לאמת זאת בעת בחינת מודל עכברים חדש. באמצעות מיון תאים מכל תת-קבוצה ובחינת המורפולוגיה שלהם, ניתן למיין תאים מכל תת-קבוצה גם לצורך ניתוח RNA או ניתוח טרנסקריפטום; בניסויי מיון יש להשתמש בלחצי מיון נמוכים ובפיתוחי אף רחבים כדי למזער את מאמץ הגזירה על התאים.

אנו ממליצים בנוסף לבדוק את טוהר התאים ואת חיוניותם לאחר כל ניסוי מיון. לבסוף, כאשר מזהים שינוי בתדירות של תת-אוכלוסייה מסוימת, חשוב לקבוע אם הדבר נובע משינוי ממשי במספר התאים באותה תת-אוכלוסייה או שמא הוא נובע משינויים בתת-אוכלוסיות אחרות. לכן, בנוסף למדידת תדירויות תתי-האוכלוסיות, תמיד יש למדוד גם את המספר המוחלט של התאים בכל תת-אוכלוסייה.