זרימה Cytometric ניתוח של שלפוחית חוץ-תאית ממדיה ממוזגים-תא

צלבים חוץ-תאיים משמשים יותר ויותר כסמן ביולוגי אבחוני וכלי טיפולי פוטנציאלי בתחום רב. זרימה Cytometric היא השיטה האנליטית ישר קדימה ביותר לאפיון על ידי סמנים פנים חליפה פרוטוקול זה יכול לשמש בניתוח חלקיק בגודל, הוא מהיר, והוא חל על סיסמומטרים קונבנציונליים ללא צורך בהגדרה מיוחדת או המכשיר הייעודי. למרות פרוטוקול זה משמש כדי לסווג Vesicles חוץ תאיים מן המצב אמר ובינוני, זה יכול להיות מורחב לקראת סיווג של דם הגיע AVs, כדי להחליף ביופסיות רקמות פולשניות בחולים.

עבור חוקרים חדשים בפרוטוקול, חיוני לבצע צעדים המתוארים בסעיף שיטת ההגדרה, ולעקוב מקרוב אחר אסטרטגיות ההזנה המודגמות בגין על ידי ציפוי 55 ס"מ בריבוע פטרי-כלים עם 02%porcine עור ג'לטין, ב PBS. אחרי 15 דקות, לשטוף את המנה ואת הצלחת 4.4 פעמים 10 לתאי אבי הלב החמישי על כל מנה ב 7 מיליליטר של המדיום של Iscove שונה Dulbecco, או IMDM, בתוספת 20% סרום שור עוברי, ו 1% פניצילין וסטרפטומיצין עבור הדגירה שלהם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. כאשר התאים מגיעים כ 80% confluency, לשטוף את התרבויות פעמיים עם PBS של Dulbecco ללא סידן ומגנזיום ולהאכיל את התאים עם 10 milileters של מדיום ייצור exosome ללא סרום.

לאחר 7 ימים, בריכת המדיום הממוזג מכל צלחת, לתוך צינור צנטריפוגה פוליפרופילן יחיד צנטריפוגה המדיום כדי להסיר את כל פסולת התא. מעבירים את העל-טבעי לצינור מסנן צנטריפוגה של 100 קילודלטון, ומרכזים את המדיום המטוהר, הממוזג, עם צנטריפוגה נוספת. מעבירים את התרכיז לצינור מיקרו צנטריפוגה לצנטריפוגה סופית על הספסל ומוסיפים את העל-טבעי לצינור מיקרו צנטריפוגה עבה של קיר פוליקרבונט.

מלא את הצינור עם PBS, לנפח סופי של 3.2 milileters, טען את המדגם לתוך רוטור מלאך קבוע טיטניום. לאחר מכן לטעון את הרוטור לתוך אולטרהצנטריפוגה שולחן עבור ultracentrifugation, ו resuspend את גלולה ב 100 microliters של PBS טרי. עבור מעקב חלקיקים וכימות ניתוח, לדלל 1 microliter של המדגם אולטרה מרכזי, ב 999 microliters של PBS, ולטעון את המדגם לתוך מזרק 1 milileter ללא בועות.

טען את המזרק לתוך יציאת המזרק של תא הבדיקה, והדליק את הלייזר. השתמש בלחצן הלכידה כדי לפתוח את המצלמה ולהתאים את המוקד. לאחר מכן הקליט לפחות שלוש מסגרות שונות של 60 שניות כל אחת, ולהשתמש באפשרות תהליך האצווה בתוכנה, כדי לנתח את שלוש הרכישות השונות.

כדי להכין את הדגימה לרכישה, תחילה להוסיף את הנוגדן המונוקלוני הניסיוני המתאים חסידות לכידה ביחס 1:1:1, לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה, ומערבולת בריכת חרוזים לכידת וכתוצאה מכך. לאחר מכן, להוסיף את הנפח המתאים של מדגם 1 microliter של בריכת חרוזים ללכוד כדי ליצור 1 פעמים 10 ל 8 חלקיקים בתוספת 1.2 פעמים 10 כדי 5 חרוזים לכל ריכוז הבדיקה. הוסף 1 microliter של חרוזים לצינור שכותרתו חרוזים כמו שליטה שלילית, ולהתאים את עוצמת הקול בכל צינור ל 100 microliters עם PBS טרי.

לאחר מכן מניחים את הצינורות במיקסר תרמו, עם רעידות, ב 400 סיבובים לדקה, ו 4 עד 10 צלזיוס, לילה. למחרת, להעביר את הדגימות לתחתית עגולה 96 צלחת היטב, ולהוסיף את הנוגדנים חידה florescence המתאים לכל באר. לאחר דגירה של שעה ב-4 עד 10 מעלות צלזיוס, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS לכל באר, פתחו את תוכנת הרכישה.

בחר ציטומטר ותוכנית הפעלת מערכת, כדי להפעיל את המכשיר ולפתוח ניסוי חדש. צרו תבנית ניסיונית ובחרו לוח והוסיפו צלחת. בחרו במיקום הדגימות על הלוח ולחצו גם על 'קבע' כדגימה.

הזינו את השם לדוגמה בכללי מתן השמות, פתחו את לשונית הערוץ ובחרו בערוצי האות המתאימים. עכשיו תעמיס את הלוחית לתוך המכשיר. ולחצו על התוויית נקודה, כדי ליצור אזור פיזור קדמי חדש לעומת חלקת נקודה של אזור פיזור צד.

בחר אתחל כדי להפעיל את הלייזר ואת fluidics ולחץ על לרוץ כדי להתחיל את הרכישה. התאם את קנה המידה כדי להראות את האוכלוסייה באמצע חלקת פיזור קדימה לעומת צד, ולצייר שער חרוזים סביב כל אוכלוסיית המדגם כדי לא לכלול את ההריסות. לחץ על עצור ועל חלקת נקודה כדי ליצור גובה פיזור קדימה לעומת חלקת נקודה של אזור פיזור קדימה, ושער המדגם על אוכלוסיית חרוזים.

ציירו שער חדש סביב האוכלוסייה הגדולה יותר ותנו לו Singlets, ולחצו על חלקת נקודה כדי ליצור אות פלואורסצנטי אחד לעומת חלקת נקודה של אזור פיזור צד, לכל פלואורופור ניסיוני בשימוש. שער חלקת הנקודה החדשה על סינגלים. לאחר מכן בחר את מספר האירועים שיש להקליט ובחר רשומה כדי להתחיל את הרכישה הניסיונית.

בסוף הניתוח, טען את קבצי הרכישה לתוכנה המתאימה לניתוח ופתח פרוטוקול חדש. צור התוויות נקודה עבור כל קובץ כפי שהודגם זהה, והגדר את כל ציר ההתפזרות לקנה מידה ליניארי ואת כל הציר הפרחי כדי לשנות את קנה המידה של הרישום. לאחר מכן הצג את הממוצע הגיאומטרי florescence בערוצי האותות הרלוונטיים, כדי לחשב את השינוי המלא בעוצמת florescence ממוצע, בהכנות ורידים חוץ תאיים שונים.

לאחר בדיקת תנאים שונים כדי להגדיר את הכמות הכוללת הקטנה ביותר של ורידים חוץ-תאיים כדי להגיע לשלב המעריכי המוקדם של עקומת עוצמת פלורסנס ממוצעת, המספר המינימלי של חלקיקים נקבע להיות 1 פעמים 10 עד 8 חלקיקים לכל הכתמה. הריכוז האופטימלי של נוגדנים עבור 1 פעמים 10 כדי 8 חלקיקים כדי להשיג את האות הגבוה ביותר ללא מחייב נוגדנים לא ספציפיים, נקבע להיות 10 מיקרוגרם למיליליטר עבור נוגדנים נגד CD9_FITC ואנטי CD63_PE וחמישה מיקרוגרם למיליליטר עבור נוגדן אנטי CD81_PE. כדי לאשר את התאמת השיטה, לניתוח ורידים חוץ-תאיים בצורת, ולא פסולת קרום, הווסקולים החוץ-תאיים היו sonicated, וכתוצאה מכך ירידה בעוצמת הפלורזנס הממוצע, לאחר 30 שניות בלבד של sonication, ללא florescence זוהה בכלל לאחר דקה אחת של הפרעה מכנית.

הטיהור של X עצמו מתאי הצאצאים הלב כפי שהודגם, מניב יבולים חוץ-תאיים, המבטאים רמות נמוכות של CD9 ורמות גבוהות של CD63 ו- CD81 משתי אוכלוסיות התאים. יתר על כן, בעוד סמני פני השטח של X עצמם ניתנים לזיהוי בבירור ללא אולטרהצנטריפוגציה, צעד העשרה זה משפר מאוד את עוצמת הפלורסנטיות הממוצעת של סמנים אלה. כאשר עובדים עם ערכות חוץ-תאיות, ניתן לפספס בקלות כדורי חלקיקי ננו רשלנים יותר.

לכן, חיוני לבצע את כל הצעד כפי שהוכח בפרוטוקול. שימוש בווסקולים חוץ-תאיים כסמן ביולוגי הוא כיום אחד ממחקרי השטח המתעוררים ביותר. ובקרוב, עשוי להיות מתורגם לאבחון הקליני המשמש ככלי סינון חלופי.