כימות של פעילות Cis-Regulatory אלמנטים ברשתית עכבר ידי electroporation Explant

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבצע אלקטרופורציה לשתולי רשתית של עכבר עם דיווחים תעתוקיים פלואורסצנטיים ולכמת את רמות הביטוי שלהם. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד רקמת רשתית של עכבר ניאונטלי באמצעות דיסקציה. השלב השני של הפרוצדורה הוא ביצוע אלקטרופורציה לרשתית באמצעות מבני דנ"א של דיווח פלואורסצנטי.

השלב השלישי של הפרוצדורה הוא גידול של הרשתיות שעברו אלקטרופורציה כשתלים למשך שמונה ימים. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא קצירת נתח הרשתית (explan) וכימות רמות הביטוי של הדיווחים הפלואורסצנטיים. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות את רמות הביטוי היחסיות של מבני פרומוטר-דיווח שונים ברשתית של עכבר בשלבי התפתחות, באמצעות אלקטרופורציה של נתח הרשתית, ולאחריה ניתוח נתונים כמותי.

שמי ג'ו קורבו ואני חבר סגל במחלקה לפתולוגיה ואימונולוגיה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס. היום נציג פרוטוקול וידאו המדגים את הטכניקה של electroporation של תכשירים (ex vivo) לרשתית של עכברים בניו born, לצורך כימות פעילות של אלמנטים רגולטורים של CYS הספציפיים לפוטורצפטורים; תדגים את הפרוטוקול הזה סינדי מונטנה, סטודנטית לתואר מתקדם מהמעבדה שלי. ראשית, סטריליזציה של תא ה-electroporation וכל המכשירים באמצעות 70% ethanol כהכנה לאיסוף העיניים.

חטאו את הכפפות ואת משטח העבודה באתנול ושמרו על תנאים סטריליים לאורך כל הפרוצדורה. לאחר מכן, בתוך מנדף לתרבית רקמות, העבירו בעזרת פיפט שש מיליליטר של מדיום לדיסקציה לכלי Petri סטרילי אחד בקוטר 60 מילימטר, ושלושה מיליליטר של מדיום לשני כלי Petri סטריליים בקוטר 35 מילימטר. בחזרה על משטח העבודה, חטאו את הראש והצוואר של גור עכבר ניבולד באמצעות 70% ethanol.

לאחר ביצוע עקירה מהירה של הראש באמצעות מספריים, העבירו את הראש לפיתה סטרילית של 100 מילימטר, הסִירו את קרקפת הראש בעזרת מספריים קטנים כדי לחשוף את העיניים תחת מיקרוסקופ דיסקציה. בעזרת פינצטה קמורה, הוציאו בעדינות את העין מתוך המגלף והניחו אותה בפיתה של 35 מילימטר המכילה תמיסת דיסקציה. המשיכו לאסוף עיניים כך שיהיו שלוש עד ארבע עיניים לכל מנה של DNA המיועדת לאלקטרופורציה, תוך שמירה על העיניים ותמיסת הדיסקציה בטמפרטורת החדר עד לסיום הפעולה.

חטאו הן את להב התערה והן את עטיפתה של פיפטת העברה פלסטית סטרילית באמצעות 70% ethanol, ולאחר מכן השתמשו בלהב התערה כדי לחתוך את קצה הפיפטה בגובה מספיק כדי שניתן יהיה לשאוב עין שלמה. באמצעות הפיפטה שהורחבה, העבירו עין אחת מהצלחת בעלת ה-35 מילימטר למשקית בעלת ה-60 מילימטר תחת מיקרוסקופ דיסקסיבי בהגדלה גבוהה. השתמשו בפינצטה עדינה כדי להסיר רקמות, כגון שרירי העין החיצוניים ושומן, מפני השטח של העין.

לאחר מכן, הסירו את העצב האופטי על ידי צביטה בבסיסו. כדי לבודד את הרשתית, צרו חור קטן בסקלרה (לחמיות העין) באזור הלימבוס; הסקלרה והאפיתל הפיגמנטי של הרשתית נראים מבריקים ביחס לרקמת הרשתית, שנראית באפור מט. הכניסו זרוע אחת מכל אחד מזוגי הפינצטות אל תוך החור וקרעו בעדינות את הסקלרה ואת ה-RPE.

הקפידו להשאיר את העדשה במקומה. השתמשו בפיפטה המורחבת כדי להעביר את הרשתית המנותחת לכלי 35 מילימטר שני המכיל מצע גידול. אספו את כל הרשתיות ואחסנו אותן באינקובטור לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 degree Celsius.

עד לשלב האלקטרופורציה, בעבודה תחת מנדף לתרביות רקמה, מלאו עבור כל מנה של DNA המיועדת לאלקטרופורציה צלחת סטרילית אחת בקוטר 35 מילימטר במדיום דיסקציה וצלחת שנייה במדיום תרבית. באמצעות פיפטה P 200, שטפו את התאים בצלחת האלקטרופורציה עם one XPBS סטרילי 3 פעמים. מלאו את התאים במנות של 60 microliter DNA, ומלאו את כל התאים שאינם בשימוש ב-60 microliters של one XPBS.

חברו את האלקטרודות לצלוחית האלקטרופורציה והזינו את ההגדרות המתאימות במכשיר האלקטרופורציה. השתמשו בפינצטה עדינה כדי לתפוס את הרשתות בעזרת העדשה והעבירו אותן לתאי האלקטרופורציה. הניחו עד ארבע רשתות בכל תא.

סדרו את הרשתות כך שהעדשה תישען על מוט המתכת המחובר לאלקטרודה החיובית. נגבו את הפינצטה בין תא לתא כדי למנוע מעבר של DNA מתא אחד למשנהו. לאחר שכל הרשתות מיושרות, לחצו על כפתור ההפעלה (start) במכשיר האלקטרופורזה.

בועות קטנות אמורות להיווצר על מוט המתכת המחובר לאלקטרודה השלילית. נתק את האלקטרודות וכבה את מכשיר האלקטרוליזה באמצעות פינצטה. הרחק בעדינות את הרשתות מדפנות התא.

העבירו את הרשתיות מהתאים אל צלחות של 35 מילימטר המכילות מדיום לניתוח. בעזרת פיפט העברה סטרילית, העבירו את הרשתיות ממדיום הניתוח אל צלחות של 35 מילימטר המכילות מדיום תרבית. סמנו את הבארות של פלטת תרבית סטרילית בעלת שש בארות ומלאו כל בארה ב-3 מיליליטר של מדיום תרבית.

השתמשו בפינצטה סטרילית כדי להניח מסנני watman nucleo עגולים על פני המצע בכל באר, כאשר הצד המבריק של המסננים פונה כלפי מעלה. בעזרת מיקרוסקופ סטריאוסקופי (dissecting scope), העבירו רשתית אחת על המסנן באמצעות פיפטת העברה סטרילית, כאשר צד העדשה פונה כלפי מטה. אם הרשתית נחתה כאשר צד העדשה פונה כלפי מעלה, שאבו אותה חזרה אל הפיפטה ונסו שוב.

הניחו לא יותר מארבע רשתות בכל באר ושמרו אותן בטיפות נפרדות. לאחר הנחת הרשתות בבארה, העבירו את פלטת התרבית למדגרה לתרביות רקמה בטמפרטורה של 37 °C וגידלו למשך הזמן הרצוי. בדרך כלל, שמונה ימים כפי שמוצג כאן, תוצאות אלקטרופורציה מוצלחות מובילות לביטוי של מבנה ה-DNA על פני רבע עד שליש משטח הרשתית.

רמות הפלואורסצנציה נמדדות על ידי השוואה בין אזורים שעברו אלקטרופורציה אחידה ומבטאים את מבנה ה-CRE לבין אזורים מחוץ לרשתית, ולאחר מכן נורמליזציה ביחס לביטוי GFP של ביקורת. נראה כי פוטורצפטורים מסוג rod עוברים טרנסדוקציה ביעילות רבה במיוחד. להלן תוצאות של אלקטרופורציה שבה שני קידומים (promoters) ספציפיים ל-rod מניעים ביטוי של GFP ו-DS red בשכבה הגרעינית החיצונית.

על ידי הלבשת שתי תבניות הביטוי עם צביעת DPI המוצגת כאן בכחול, ניתן להבחין בביטוי הספציפי לקולטנים הפוטו-אלקטריים. לא נצפה ביטוי לא בשכבה הבין-צלולית ולא בשכבת תאי הגנגליון. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם תמונה ברורה לגבי אופן ביצוע הדיסקציה, האלקטרו-קלטורה של השתלי רשתית מעכבר לצורך כימות הפעילות של אלמנטים רגולטוריים של ציסטות ברשתית.

תודה שצפיתם ובהצלחה בניסוייכם.