ין העברת לאוזן הפנימית על ידי פיתוח מאוס

ג'יין העבירה את "פיתוח האוזן הפנימית של עכבר באמצעות אלקטרופורציה in Vivo", מאת Ling Wang, Han Jang ו-John Burgandy, ממרכז המחקר לשמיעה של אורגון, אוניברסיטת הבריאות והמדעים של אורגון. שלום. שמי הוא John Burgandy. המעבדה שלי נמצאת במרכז המחקר לשמיעה של אורגון באוניברסיטת הבריאות והמדעים של אורגון.

שמי Ang. אני דוקטורנט במעבדתו של Johns. אני Ang, כמו כן, עובד במעבדתו של Johns כעוזר מחקר.

המצגת שלנו מחולקת לארבעה חלקים. הראשון הוא לפרוטומיה ונטרלית. אנו מדגימים הרדמה מבוססת sodium pentobarbital, כיצד לבדוק את מידת יעילות ההרדמה, הגנה על הקרנית, הכנת אזור הניתוח, חיטוי, גיליון נתונים של ניתוח הישרדות בעכברים, סביבת הניתוח, חתך בקו האמצע הוונטרלי דרך העור ודופן הבטן, וחשיפה חיצונית של קרני הרחם.

חלק שני עוסק במיקרו-הזרקה דרך הרחם. אנו מדגימים תאורה חוצנית של העובר, ארגון מחדש של העובר, מיקרו-הזרקה, ייצור פיפטות, ומיקרו-הזרקה לאוזן ביום עוברי 11.5 וביום עוברי 12.5. חלק שלוש עוסק באלקטרופורציה in vivo.

אנו מדגימים הצבה של אלקטרודות מסוג משוט (paddle style), ואלקטרופורציה של שוער עזר בעכבר ביום עוברי 11.5. חלק ארבע מציג תוצאות מייצגות. אנו מראים את הביטוי של GFP בשבלולים בשלב עוברי מאוחר ובשלב פוסטנטלי מוקדם.

תוצאה זו התקבלה לאחר אלקטרופורציה in vivo של ה-Otis עם פלסמיד ביטוי ביום עוברי 11.5. חלק ראשון: לפרוטומיה ונטרלית. הנקבה מוחזקת בבטחה על ידי אחיזת העור מאחורי הצוואר, הזנב והגפה האחורית השמאלית. הזרקה אינטריפריתונית של חומר הרדמה מבוסס סודיום פנטוברביטל ניתנת לאחר ניגוב הבטן ב-70% ethanol.

העכבר ממוקם בתוך כלוב הבית שלו למשך ארבע עד חמש דקות כדי לאפשר לחומר ההרדמה להשפיע. צביטות בכף הרגל ובזנב משמשות להערכת מידת ההרדמה. במקרה זה, האם רועדת בתגובה לצביטה בזנב וזקוקה לשתי דקות נוספות לפני שתהיה חסרת תגובה לגירויים מזיקים.

משחה עינית סטרילית נמרחת על העיניים כדי להגן על הקרניות מהתייבשות. אנו מכינים את אזור הניתוח במכסירית כימית כדי למזער את הפצת הפרווה והקשקשים. הפרווה מגולחת בעזרת להב עדין כדי לחשוף את העור המכסה את דופן הבטן.

הסרה מלאה של הפרווה מקלה על ריפוי החתך לאחר הניתוח. חיטוי עור הבטן מבוצע על ידי ניגובים לסירוגין של 70%ethanol, Betadine ו-70%ethanol. יש לנגב תמיד בכיוון מהחלק הקדמי (rostral) לכיוון הזנב (caudal) ולהשתמש בכדור צמרון כירורגי חדש או במקלון צמרון.

בכל מעבר, אנו מעריכים את עומק ואיכות הנשימות במהלך החיטוי כדי לוודא שהנקבה אינה מגיבה. לאחר המעבר השני עם 70% ethanol, הנחנו מיד את הנקבה כאשר הצד הגחוני פונה כלפי מטה על בד סטרילי והנחנו אותה על פד מחומם למשך שתיים עד שלוש דקות כדי לחמם אותה. זהו זמן נוח להקליט נתונים טרום-ניתוחיים בגיליון רישומי ניתוחי הישרדות עכברים. צירפנו את גיליון נתוני ניתוחי הישרדות העכברים שלנו כמידע משלים.

שקלו לצרף את גיליון הנתונים ואת פרוטוקול הטיפול בבעלי החיים שלכם, כך שוועדת האתיקה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המוסד שלכם תוכל לראות כיצד תנטרו את הנתונים לפני הניתוח, במהלך הניתוח ואחריו. אנו ממלאים גיליון רישום אחד עבור כל נבדק שעבר ניתוח. אנו מעדיפים לבצע את הניתוח בסביבה סטרילית, אם כי הדבר בדרך כלל אינו נדרש עבור מכרסמים.

משטח העבודה נפרד ממנוע המפוח ומבית הפלוניום, כך שאין רטט המועבר למשתמש. במהלך המיקרו-הזרקה, צירפנו כמידע משלים תרשים של השינויים שביצענו במכסה המגנה למשטח עבודה בזרימה למינרית כדי להקל על העברה גנטית In utero; השינויים המהותיים הם אתגר בעוצמה נמוכה, חריצים לתאורת מסלול ושקעים נסתרים לכבלי חשמל של מכשירים, ונתיב להעברת מעגלים חשמליים נלווים. חדר הניתוח מורכב משקית IV של תמיסת lactated ringers חשמלית, אמבט חימום, מניפולטור XY, Z, מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי לניתוח, מקור אור סיב אופטי ומכשור כירורגי.

דוואשות משמשות להפעלת המיקרו-אינג'קטור, המערכת לאלקטרופורציה וכוון המיקוד. המכשירים הכירורגיים של המיקרוסקופ עוברים סטריליזציה באוטוקלאב. יש לבצע סטריליזציה חוזרת למכשירים בין עכבר לעכבר באמצעות סטריליזטור חרוזי זכוכית או על ידי סטריליזציה חוזרת של תומך המחט באוטוקלאב.

פינצטות טבעת של Balli ופינצטות כלי דם הן הכלים החיוניים. בצעו חתך בקו האמצע הגחוני, תפסו את העור באמצעות פינצטות כלי דם והסִירו את השכבה החיצונית עם מספריים בעלי קצה כדורי, והרחיבו את החתך ל-10 עד 14 Millimeters. זהו את רצועת הרקמה החיבורית הלבנה והחסרת כלי דם המכונה linea alba בקו האמצע הגחוני של הבטן, ובצעו חתך ב-linea alba באמצעות המספריים בעלי הקצה הכדורי.

יש להיזהר לא לפצוע את המעי או את כריות השומן המפשעיים. יש לשטוף מיד את הבטן עם תמיסת lactated ringer סטרילית שחוממה מראש. יש לבחון את אתרי החתך בעור ובדופן הבטן כדי לוודא שאין דימומים.

לחץ ישיר באמצעות פינצטה קהה יעצור דימומים קלים אם קיימים; הוצאו את קרני הרחם הימנית והשמאית החוצה באמצעות פינצטה עם קצוות טבעתיים. תפסו בעדינות את קרן הרחם הימנית עם קצה טבעתי אחד של הפינצטה ומשכו את הרחם לעבר החתך במרכז. השתמשו ביד החופשית כדי להזיז בעדינות את הצד הלטראלי של נקבת הרחם כדי להקל על תפיסת הרחם.

אין להשתמש בפינצטה כדי לדחוס את הרחם ולמשוך אותו החוצה. מכיוון שפעולה זו עלולה לפגוע בכלי הדם של הרחם או בעוברים, חזור על הליך ההוצאה עבור הקרן הרחמית השמאלית. שטוף מיד את קרני הרחם שהוצאו באמצעות תמיסת lactated ringer שחוממה מראש, והחזר בעדינות את רפידי השומן הפנימיים או את המעיים במידה ויצאו יחד עם הרחם.

מצב זה אינו נפוץ. חלק שני: הזרקה מיקרוסקופית לרחם. נקבת האם ממוקמת תחת עדשה בעלת מרחק עבודה ארוך, ותאורת סיב אופטי רכה מוצמדת לדופן הרחם.

לחצו בעדינות על הרחם בעזרת אצבע של היד החופשית, כדי להקל על זיהוי כיוון העובר. יש להשתמש בעוצמת האור הנמוכה ביותר מהכבל הסיב אופטי שעדיין מאפשרת להעריך במדויק את כיוון העובר.

אור בעוצמה גבוהה עלול להעביר חום לרחם, דבר שעלול לגרום לסיבוכים. אנו מחזיקים את תאורת הסיב האופטי ואת הרחם ביד אחת, ומשתמשים באצבע מהיד הפנויה כדי למקם מחדש את העובר באמצעות מישוש עדין. אנו מדגימים זאת בשלושת סרטוני ה-EC הבאים במיקרוסקופיה, וכן את האוריינטציות הנפוצות של העובר הנצפות ברחם.

הצופה יראה את התצפית המיקרוסקופית שאנו רואים במהלך תאורה חדירה (trans illumination), אם כי בתאורה חדירה בשחור לבן של הרחם ניתן לזהות את אוריינטציית העובר in vivo. בדוגמה זו, העובר נמצא במצב של עמידה על הראש כאשר פניו הגבונים פונים לצופה. על ידי הנעת הרחם קדימה ואחורה, ניתן לזהות את הגפיים האחוריות הימנית והשמאלית, את הזנב ואת ראשו של העובר (cephalon) בצד שמאל.

בדוגמה זו, העובר נמצא שוב בעמידה על הראש, אך מסובב בכ-90 מעלות ביחס לציר הקדמי-אחורי. על ידי הנעת הרחם קדימה ואחורה בעדינות, ניתן לראות את צורות המשוטים המגדירות את הגפה האחורית השמאלית ואת הגפה הקדמית השמאלית. גם המוח האחורי ניכר.

העובר נמצא במצב זקוף כאשר צדו השמאלי פונה לצופה. ניתן לזהות את המערכה הרביעית המתהווה ככתם בהיר במוח האחורי. גם העין השמאלית, הגפה הקדמית השמאלית והגפיים האחוריות השמאליות נראות בבירור.

לחץ עדין על הרחם משנה מעט את מיקום העוברים כדי לאפשר זיהוי של הגזע הראשי של וריד הראש הראשוני והסניפים הקדמי והאחורי שלו, המסומנים בכוכבית לבנה ושחורה בהתאמה. כפי שנראה, ה-Otis ממוקם באמצע הדרך בין הסניפים הקדמי והאחורי של וריד הראש הראשוני. לא ניתן לראות את ה-Otis עצמו דרך הרחם באמצעות תאורה חוזרת (transillumination).

אנו מדגימים בשני סרטוני מיקרוסקופיה רצופים כיצד להגדיר מחדש את כיווןו של העובר לצורך מיקרו-הזרקה לתוך ה-Otis assist. המטרה היא לזהות את נקודות הציון העובריות המאפשרות אינטרפולציה של מיקום ה-otis בחלק הלטרלי של הראש. בהתאם לכך, מטרתנו היא לשנות את כיווןו של העובר ממנח דורסלי למנח לטרלי כדי שנוכל לזהות את וריד הראש הראשוני.

המזנצפאלון (המוח האמצעי), הרביעון הרביעי של המוח והגפה השמאלית נראים במיקום הגבי. לחץ עדין על הרחם משנה את כיוון העובר ממיקום גבי למיקום צדי. העין השמאלית, הראש, המזנצפאלון והרביעון הרביעי נראים בבירור.

וריד הראש הראשי והענף האחורי שלו, המסומן בכוכבית, בולטים אף הם. הענף הקדמי של וריד הראש הראשי אינו מזוהה בבירור. מטרתנו, שוב, היא להכווין את העובר כך שניתן יהיה לזהות את וריד הראש הראשי, אך תחת הגבהרה גבוהה יותר המתאימה להזרקה מיקרוסקופית לרחם.

במבט צדי זה נראים כלי הדם הרחמיים, הפס הדצידואלי והעין השמאלית. לחץ עדין על הרחם משנה את מיקומו של העובר, כך שניתן לזהות את הרבעי השביעי והעין השמאלית. וריד הראש הראשוני והענף האחורי שלו המסומן בכוכבית; וריד הראש הראשוני וענפיו יוצרים צורה של קוL של שער פוטבול אמריקאי.

לא ניתן לראות את שלפוחית האוזן (otic vesicle) דרך הרחם, אך היא ממוקמת במרכז התומכים. לין התחילה רצף הזרקה עבור עובר אחד. היא מבצעת תאורה נגדית (trans illumination) של הרחם, מכוונת מחדש את העובר לצורך מיקרו-הזרקה, ומביאה לשדה הראייה את פיפטת המיקרו-הזרקה הממולאת ב-fast green.

פיפט המיקרו-הזרקה מחוברת למחזיק פיפט המוחזק על ידי מיקרו-מניפולטור בעלי צירים X, Y ו-z. המעמד המגנטי של המניפולטור מחובר ללוח פלדה עם בסיס טפלון המאפשר מיקום גס ללא מאמץ של פיפט המיקרו-הזרקה. את המחט מקדמים באופן מתאים באמצעות כפתור בקרת המיקרומטר קדימה של המניפולטור.

פיפטות מיוצרות הן חיוניות להזרקה מיקרוסקופית טראומטית לעובר עכבר בשלב Otis מוקדם. אנו מושכים צינוריות קפילריות מזכוכית בורוסיליקט בעלות דפנות עבות באמצעות מושך פיפטות אופקי. הפיפטה המתקבלת המוצגת ב-A נשברת ידנית בעזרת פינצטה במיקום שבו הקוטר החיצוני הוא כ-14 עד 16 מיקרון, כפי שמסומן על ידי ראש החץ ב-B. השבירה הגסה של הפיפטה המוצגת ב-C היא משוננת ושבירה.

אנו מיישפים את הפיפטה בזווית של כ-20 מעלות כדי להחדד את קצה הפיפטה כפי שמוצג בפנל D; פרמטרים למשיכה ולישוף של פיפטות למיקרו-הזרקה מופיעים בטקסט הנלווה. בשני סרטוני המיקרוסקופיה הבאים נדגים מיקרו-הזרקה לאוזיקולה (otic cyst) של עכבר בימים עובריים 11.5 ו-12.5. מטרתנו היא להדגים מיקרו-הזרקה רחמית לאוזיקולות של עכבר ביום עוברי 11.5.

ראשית, אנו מזריקים את החומרים ללא הרחם כדי להראות באופן חד-משמעי כיצד נראית הזרקה המכוונת כהלכה. לאחר מכן, נדגים הזרקה מיקרוסקופית אותנטית דרך הרחם. עבור הזרקה ראשונה זו, הרחם נחתך באופן מלא כדי לאפשר לשקיות הוויסראליות לבלוט, והפס דצידואלי המכסה את שקיק החלמון הוויסראלי הוסר.

השליה נשארת מחוברת לרחם והעובר חי. עם הסרה מוקדית של הרחם, אנו רואים את החדר הרביעי, את וריד הראש הראשי ואת ענפיו הקדמיים והאחוריים, את הפיפטה ואת המיקום המשוער של הציסטה בלבן. בתחילת רצף הזרקה זה, מזוהה זרימת דם בכלי הדם של שק החלמון הוויסראלי.

הפיפט מועבר דרך שקיק החלמון הוויסרלי ו-dai מוזרק לתוך ה-osis note, תעלת הלימפה האנדולימפטית בגב (dorsally) ומיקום ה-otics במרכז ה-uprights. ה-otics נמצא באמצע הדרך בין הענפים הקדמיים והאחוריים של וריד הראש הראשוני, מיקרו-הזרקה רחמית לתוך ה-otics של עוברי עכבר ביום 11.5. מיקרו-הזרקה רחמית לתוך ה-otics של עוברי עכבר ביום 11.5 דורשת זיהוי של וריד הראש הראשוני ולפחות אחד מענפיו כדי להעריך את מיקום ה-otic assist.

בדוגמה דיאגרמטית זו, שני הענפים, הקדמי והאחורי, של וריד הראש הראשי מזוהים, כאשר אזור ה-OUC מסומן בלבן. ייצוג ריאליסטי יותר של העובר הוא כזה שבו גזעו הראשי של וריד הראש הראשי מזוהה יחד עם אחד מענפיו בלבד; בדוגמה המוצגת נראה רק הענף האחורי של וריד הראש הראשי, אך הדבר מספיק כדי לפרש את מיקומם של ה-otics. ה-PT מועבר דרך הרחם וצבע מוזרק לתוך ה-otics.

אנו ממתינים 30 שניות כדי לאפשר לצבע להתנקות מחלל מי השפיר, ובשלב זה ניתן לראות את התעלה האנדולימפטית בצד הגבי ואת המבוא (vestibule). אנו מסיימים בתצפית בהגדלה נמוכה של העובר שאת הציסטה שלו הרקנו כעת, כדי לספק פרספקטיבה אנטומית במבט זה, שבו ניתן לראות את החדרי הרביעי, את העין השמאלית ואת כלי הדם הרחמיים. אנו מדגימים הזרקה ומיקרו-הזרקה לתוך הציסטה האוטיקה של עכבר ביום העוברי 12, ומיקרו-הזרקה לתוך החדרי הרביעי המתפתח של המוח האחורי.

תאורה בניגוד (Transillumination) מאפשרת לנו לזהות את וריד הראש הראשי במבט צדדי שמאלי זה, כמו גם את העין. הפ pipette מועברת דרך הרחם אל תוך השקיק האוטי (otic vesicle) וצבע מוזרק כדי למלא את חללו. כדי להזריק למדורה הרביעית, נסובב את העובר ב-90 מעלות לקבלת מבט גבי (dorsal view) של המוח האחורי.

הציסטה השמאלית המוזרקת נמצאת כעת בצד שמאל. הפפיפטה מועברת דרך הרחם ו-fast green המעורבב עם lor. דקסטראן מזווג מוזרק לחדר הרביעי.

שימו לב כי נפח הצבע המוזרק אינו חודר למרכז המוח (midbrain) in vivo. הפלואורסצנציה נבדקת לאחר ההזרקה כדי לאמת את מיקומו של הדקסטראן בחדר הרביעי. לאחר מכן, העובר מונח מחדש ממצב גבי (dorsal) למצב צדי (lateral).

התעלה האנדולימפטית נמצאת ממש ונטרלית למערכה הרביעית במבט צדי זה. פלואורסצנציה in vivo מאשרת את מיקום הדקסטראן במערכה הרביעית. בלידה, אנו סורקים גורים לאיתור פלואורסצנציה ירוקה במערכה הרביעית באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה אפיגנרי.

בבדיקה תחת מיקרוסקופ דיסקסקציה, גורי חולדות בעלי פלואורסצנציה ירוקה במוח האחורי בעלי אוזן פנימית שעברה מניפולציה במהלך העוברים, חלק שלישי: אלקטרופורציה in vivo. לאחר מילוי הציסטה בפלסמיד ביטוי, מרשקים את הרחם בתמיסת lactated ringer שחוממה מראש. תאורה נגדית מסייעת במיקום הציסטה של ה-ODU במרכז שדה האלקטרודות.

ראש המתכת של סיב האור מורחק מפני הרחם. לפני תחילת רכבת פולסי גל ריבועי, נדגים בסרטון המיקרוסקופיה הבא מחזור אלקטרופורציה מלא in vivo. אלקטרופורציה של הציסטה האוטיקה בעכבר ביום עוברי 11.5 דורשת הצבה עדינה של האלקטרודות מסוג מטעמים (paddle style electrodes) על הרחם.

בדוגמה זו, הציסטה האוטיקה השמאלית מולאה בפלסמיד ביטוי והרחם שוטף באופן טרי ב-lactated ringers. הקתודה ממוקמת לטרלית ביחס לציסטה האוטיקה המלאה, והאנודה ממוקמת מדיאלית; בתחילת רצף הפעולה, הציסטה האוטיקה ממורכזת בשדה המגפים. הרחם נדחס בעדינות, ורצף פולסי המהלכים של גל ריבועי מופעל באמצעות מתג פדאל.

באופן אידיאלי, מועבר זרם של 60 עד מאה מיליאמפרים לכל פולס. לאחר מכן משחררים את הרחם ושוטפים אותו מיד. את הרחם השטוף מחזירים לחלל הבטן באמצעות הפעלת לחץ עדין עם פינצטת טבעת.

לאחר הפנמה של הרחם, שוטפים את חלל הבטן בכ-4 ml של Lactated Ringer's, תוך השארת כ-1 ml של Lactated Ringer's בחלל הבטן כדי לסייע בשמירה על הידרציה של נקבת האם, שתשתה פחות מים מהרגיל מיד לאחר הניתוח הבטני. סוגרים את דופן הבטן ולאחר מכן את העור באמצעות תפירה נספגת בעזרת תופס מחטים. תופס המחטים שלנו כולל מספריים מובנים המפשטים את פעולת הסגירה.

אנו מעדיפים תפר רציף הן עבור דופן הבטן והן עבור העור. אנו נועלים כל תפר שני כדי לספק תמיכה נוספת באתר החתך. אנו מגישים תרופה נוגדת דלקת שאינה סטרואידית תת-עורית לפני הנחת האם בכלוב ההתאוששות.

התייעצו עם הצוות הווטרינרי שלכם לגבי המשככי הכאבים המניעתיים המועדפים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בהם (IACUC). את הנקבה המטפחת מניחים בתוך כיסוי סטרילי על רצפת כלוב ההתאוששות המחומם. כלוב ההתאוששות מכיל חומרי קינון, צינור אדום להסתרה, מזון מעבדה ובקבוק מים.

את הכלוב מרכיבים מחדש עם כיסיית מסנן (Filter bonnet) בחלקו העליון בבוקר שאחרי הניתוח. האם (Dam) מטופחת היטב, מסוגלת להתנייד ויכולה להישען על גפיה האחוריות כדי לחקור את החלק העליון הפתוח של הכלוב. קו התפרים בבטן נקי, יבש ואינו מראה סימנים לפתיחה, אדמומיות או נפיחות.

צירפנו מסמך הדן בפיתוח פרוטוקול לטיפול בבעלי חיים עבור העברת גנים בתוך הרחם (in utero). המסמך מכיל ניסוחים שעשויים להועיל בעת עיצוב פרוטוקול ספציפי למוסדכם, בהתייעצות עם הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים. חלק ארבע, תוצאות מייצגות.

לוחות תוצאות מייצגות A ו-B מציגים שבלול מייצגת מגור של יום פוסטנטלי שישי, שבהוזרק פלסמיד לביטוי חלבון GFP ביום עוברי 11.5 ולאחר מכן בוצע אלקטרופורציה. הדופן הצידית של השבלול הוסרה מהחלק האמצעי ומהפסגא. ביטוי של GFP מופיע רק מהבסיס ועד לחלק האמצעי של השבלול, ועוקב אחר ההפצה של הסמן לתאי שיער myosin seven A המוצג בלוח B. לוח C מציג הקרנה קונפוקלית בהגדלה נמוכה של היום העוברי.

איבר קורדה של עכבר ביום 18.5, צבוע אימונוהיסטוכימית עם נוגדן ל-myosin seven A; תאים טרנספקטיים מפוזרים ברחבי איבר קורדה. פאנל D מציג תמונה קונפוקלית בהגדלה גבוהה של איבר קורדה של עכבר ביום עוברי 18.5, הצבוע ב-cin.Seven.

ביטוי של GFP מזוהה בתאי שערה פנימיים וחיצוניים, בתאי interphalangeal, בתאי pillar ובתאי TER. העברה של גנים באמצעות אלקטרופורציה ל-Otis ביום עוברי 11.5 מעבירה טרנספקציה לתאי פרוגניטור שמהם נובעים כל סוגי התאים המרכיבים את ה-organ of corde.