פסיפס ניתוח פונקציה ג'ין בפיתוח עכבר אחרי לידה המוח על ידי שימוש וירוס מבוססי רקומבינציה Cre
1 באוגוסט 2011
In vivo שיטת לבדוק תפקוד הגנים במוח לאחר הלידה מתוארת. AAVs רקומביננטי להביע Cre ו / או חלבון פלואורסצנטי מוזרקים במוח העכבר הילוד. גן פסיפס איון וסימון העצבית דלילה מושגות, דבר המאפשר ניתוח מהיר של תפקוד הגן בתהליכים קריטיים לפיתוח מעגלים עצביים.
המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשפיע על תפקוד גנים במהלך התקופה הפוסטנטלית של התפתחות המוח. דבר זה מושג תחילה על ידי בחירה והכנה של הנגיפים המתאימים, טעינתם למזרק והכנת ציוד ההזרקה. לאחר מכן, הנגיף מוזרק למוחם של גורי עכבר רך, והשלב הסופי הוא קריבת בעלי החיים והדמיית האזורים המוזרקים.
בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות סימון דיפרנציאלי של תאי בקרה ותאי knockout באמצעות מיקרוסקופיית אימונופלואורסצנציה. שיטה זו עשויה לסייע במענה על שאלות מפתח בתחום מדעי העצב, כגון האופן שבו תקופת ההתפתחות הפוסט-נאטלית מוסדרת גנטית. לצורך ההזרקה, ניתן להשתמש בתמיסת וירוס adeno-associated הזמינה מסחרית בריכוז מלא, בדרך כלל 10¹² עותקי גנום למילליליטר, כדי להשפיע על מספר גדול של תאים.
אם רצוי לקבל סימון דליל, התחילו בדילול של 1 ל-10. לאחר הפשרת הנגיף על קרח, העבירו מיד את נפח טרום-הדילול לשפופרת PCR סטרילית של 250 microliter. שמרו את הדילול על קרח.
הכינו את משאבת ההזרקה על ידי בחירת מזרק מתאים וחיבורו למחט טעינה. לאחר מכן, שאבו בעדינות את תמיסת הווירוס עד שבועה קטנה מאוד של אוויר תיראה במזרק; ניתן להשתמש בצבע טעינה אינרטי כדי להקל על שלב זה. כעת, קבעו את המזרק למשאבה באמצעות מחזיק.
לאחר מכן, חברו בעדינות צינור מקשר בין המזרק למחזיק המחט. ודאו שמחט ההזרקה נמצאת במגע ישיר עם הצינור המקשר בתוך מחזיק המחט. כעת, העבירו לאט את התמיסה דרך הצינור המקשר עד שטיפה קטנה של התמיסה תהיה נראית בקצה המחט.
הדק carefully את הבוכנה לצד בלוק הדחיפה באמצעות תושבת על המשאבה. הגדר את קצב ההזרקה ל-8 µL לדקה ואת נפח ההזרקה לנפח של בין 1 ל-2 µL. לאחר מכן, התאם את הגדרת קוטר המזרקה במשאבה לקוטר המזרקה שבה אתה משתמש.
לבסוף, כדי להגן על הגורים במהלך שלב ההתאוששות, כוון את לוח החימום ל-38 °C וכסה אותו בנייר סופג. בהתאם לפרוטוקול מאושר על ידי IACUC, הכן גורי עכבר בשלב P0 או P1 להזרקה באמצעות הרדמה בקור. הרטב מספר מגבונים עם מים והנח אותם על קרח.
לאחר מכן, הניחו ארבעה או חמישה גורים על נייר סופג במרווחים גדולים זה מזה. קפלו את נייר הספיגה מעל הגורים, הניחו בעדינות כמות קטנה של קרח גרוס מעל נייר הספיגה והשאירו את הגורים כך למשך כחמש דקות. ניתן להשאיר את הגורים על קרח בבטחה למשך עד 15 דקות ועדיין להבטיח התאוששות תקינה.
כעת מקמו גור מורדם על גוש קיבוע כדי להשיג גישה מיטבית לאתר ההזרקה. לקליפה המוחיות, לדוגמה, ניתן לגשת בקלות רבה ביותר על ידי הנחת בעל החיים בצורה שטוחה על בטנו. ניתן לקבע את הגור במקומו באמצעות פלסטר; ייצבו את ראש הגור ידנית ומתוחו את העור כדי למנוע ממנו לזוז.
לאחר מכן, התווו את נקודות הייחוס האנטומיות של הגולגולת, כגון תפר הלמדא (lambda suture), ובחרו נקודת הזרקה הניתנת לשחזור. בעזרת היד השנייה, הכניסו בעדינות את המחט דרך הגולגולת. אין להפעיל לחץ חזק אם המחט אינה חודרת בקלות לגולגולת; במקום זאת, ממרכזו מחדש את המחט ונסו שוב בעדינות.
עומק ההזרקה משתנה מעט בין בעלי חיים וזנים שונים עבור הקורטקס, כאשר עומק של חצי מילימטר עד מילימטר אחד הוא בדרך כלל יעיל. כעת, הזרק את תמיסת הווירוס בעוד קולגה מפעיל את המשאבה כדי לצמצם תנועות ידיים. באופן אידיאלי, ניתן להשתמש בדוושת רגל כדי להפעיל את המשאבה לאחר ההזרקה.
השאירו את המחט במקומה למשך מספר שניות, ולאחר מכן, תוך שמירה על ראש הגור ללא תנועה, הוציאו את המחט בתנועה חלקה. כעת, אפשרו לגור להתאושש במשך 5 עד 10 דקות על פלטת החימום המכוסה.
במהלך זמן זה, המשיכו להזריק לגורים האחרים. כאשר כל הגורים יחזירו לעצמם את גוון העור הוורוד וכולם יתחילו לזוז, שפשפו אותם בעדינות עם חלק מהמצע של ביתם. רק לאחר מכן ניתן להחזירם לאמם.
אחרת, הם עלולים להיחשב כגורים לא מוכרים, ואתם סביר להניח שהאם תהרוג לאחר שיוחזרו אליה. נקו את מערך ההזרקה על ידי מילוי מלא של המזרק באצטון או ב-70% ethanol. אם נעשה שימוש ברכיבים הרגישים לאצטון, כגון sano, acurate או דבקים, שטפו את התמיסה דרך מערך ההזרקה מספר פעמים, תוך שימוש בתמיסה טרייה בכל פעם.
פעולה זו תסיר כל שארית של תמיסת נגיפים ומשקעים, והממסים יתאדו. לאחר שטיפת המערך, חטא את אזור העבודה באמצעות אקונומיקה כדי להשאירו מוכן עבור הנסיין הבא.טכניקה מוצלחת תניב זיהום נוירונלי חזק באתר ההזרקה.
הזרקות לאזורים ספציפיים, כגון קליפת המוח והגבעול העליון (superior colliculus), יוצרות בדרך כלל זיהומים מקומיים עם התפשטות מינימלית לאזורים סמוכים. שימוש בתמיסת נגיף בעלת תרWhenever גבוהה הופך זיהום של אזורים סמוכים, כגון ההיפוקמפוס, לסביר יותר, בעוד שהזרקה של תמיסת נגיף בעלת תרWhenever נמוכה תביא לזיהום דליל, בדרך כלל בקרבת אתר ההזרקה, כפי שקורה בהזרקה לסריבל בקו התווך. מספר התאים שנדבקו אמור להיות במתאם עם הריכוז (titer) של התמיסה הנגיפית שהוזרקה.
לדוגמה, הזרקה של תערובת של תמיסות בריכוז גבוה (high titer) של שני נגיפי AAV8 המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים שונים אל השגול (cerebellum), מדביקה תאי Purkinje רבים המסומנים באופן דיפרנציאלי. לעומת זאת, הזרקה של תמיסת נגיף בריכוז נמוך עשויה להוביל להדבקה דלילה כדי לסייע בהדמיה של תאים בודדים. ניתן לצפות בנוירונים המסומנים פלואורסצנטית באופן ישיר ברקמה חיה שנסרחה טרי, או להעביREM אותם לצביעה אימונוהיסטוכימית.
פעולה זו מגבירה את אותות הפלואורסצנציה האנדוגניים לצורך רכישת תמונות מאוחרת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית במישור רחב (widefield) או קונפוקלית. לבסוף, RAAV eight מסוגל להדביק מגוון סוגי נוירונים בקורטקס עם סימון חזק של תהליכים דקים. לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצעה תוך כ-30 דקות אם היא מבוצעת כראוי.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה במודל in vivo לבדיקת תפקוד גנים במהלך התפתחות המוח לאחר הלידה באמצעות AAVs רקומביננטיים. על ידי הזרקת וירוסים אלו למוחות של עכברי יניקים, חוקרים יכולים להשיג השתקה פסיפסית (mosaic) של גנים וסימון ניורוני דליל, מה שמקל על ניתוח תפקוד הגנים בהתפתחות מעגלים עצביים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- תפקוד גנים
- התפתחות מעגלים עצביים
רקע
- הבנת תפקוד הגנים במהלך התפתחות המוח לאחר הלידה היא קריטית.
- ניתן להשתמש ב-AAVs רקומביננטיים כדי להוביל למניפולציה של ביטוי גנים.
- שיטה זו מאפשרת לחקור בקרה גנטית במהלך תקופות התפתחותיות קריטיות.
- מיקרוסקופיית אימונופלורסצנציה יכולה להבדיל בין תאי בקרה לתאי knockout.
מטרת המחקר
- על מנת לבצע מניפולציה של תפקוד גנים בתקופה שלאחר הלידה של התפתחות המוח.
- על מנת לחקור כיצד גורמים גנטיים מווסתים את ההתפתחות העצבית שלאחר הלידה.
- על מנת לספק תובנות לגבי המנגנונים העומדים בבסיס היווצרות מעגלים עצביים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בחירה והכנה של וקטורי AAV רקומביננטיים מתאימים.
- הזרקת נגיפים למוחם של גורי עכברים בניו-נאטאלס (新生児).
- מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית לדגמינג של האזורים המוזרקים.
- ניתוח של סימון דיפרנציאלי בין תאי ביקורת לתאי knockout.
תוצאות עיקריות
- הושגה השבתה מוצלחת של הגן וסימון נוירונלי.
- התוצאות מדגימות את הבקרה הגנטית של ההתפתחות postnatal.
- השיטה מספקת מסגרת למחקרי מדעי המוח עתידיים.
- התובנות שהושגו יכולות לתרום להבנת הדינמיקה של מעגלים עצביים.
מסקנות
- שיטה זו יעילה לחקר תפקוד גנים במוח המתפתח.
- הממצאים תורמים להבנת הפיתוח של מעגלים עצביים.
- מחקרים עתידיים יכולים להבסס את עצמם על גישה זו כדי לבחון השפעות גנטיות על התנהגות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת בדיקה מהירה וניתנת להרחבה של תפקוד גנים בהתפתחות המוח לאחר הלידה, ובכך היא נותנת מענה לפער קריטי בתיקוף מטרות עבור הפרעות התפתחותיות-נוירולוגיות. על ידי עקיפת מגבלות של תמותה עוברית, היא תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות טיפוליות במסלולים הרלוונטיים לאוטיזם ולסכיזופרניה. הגישה מספקת ביטחון תחזיתי בבחירת המטרה על ידי קישור הפרעה גנטית לפנוטיפים ברמת המעגל במערכת רלוונטית פיזיולוגית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקה של תפקוד גנים במעגלים עצביים לאחר הלידה, שם גנים רבים של הפרעות התפתחותיות נוירולוגיות מפעילים את השפעתם.
- ערך תפעולי: מאפשר השבתה מוזאיקת של גנים וסימון דליל תוך מספר ימים, ובכך חוסך יצירה של מודלים מותנים בעכברים הנמשכת חודשים ארוכים.
- ערך מדעי: תומך בניתוח תפקודי תא-אוטונומי של גנים המעורבים בצמיחת אקסונים, פריסה דנדריטית ודיוק סינפטי.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מייצר אוכלוסיות תאים של ביקורת ושל נוק-אאוט (knockout) הניתנות להשוואה כמותית באמצעות סימון פלואורסצנטי דיפרנציאלי להערכה פנוטיפית מקבילה.
- ערך תפעולי: מאפשר תיתוּר של הטיטר הוויראלי למודולציה של צפיפות הזיהום, מה שמאפשר סימון דליל או צפוף בהתאם לצורכי הבדיקות הבאות.
- ערך מדעי: תואם למדידות של אימונופלואורסצנציה ואלקטרופיזיולוגיה, ובכך מקל על תיקוף רב-מודאלי של מעורבות המטרה והשפעתה על המעגל.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: ממדל הפרעה גנטית לאחר הלידה בעכברים ובחולדות, בהתאמה לתזמון ההתפתחותי של הופעת הפרעות נוירופסיכיאטריות בבני אדם.
- ערך תפעולי: נשען על הובלה לנטיבירית ומבני shRNA/dominant-negative, ובכך מרחיב את ארגז הכלים למודולציה של מטרות לצורך תיקוף פרה-קליני.
- ערך מדעי: מאפשר חקר של תפקוד גנים בתהליכים קריטיים כגון יצירת סינפסים, דבר הרלוונטי ישירות למנגנונים פתופיזיולוגיים בהפרעות פסיכיאטריות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, ותומכת בתיקוף מטרות ובזיהוי מובילים (leads) על ידי אספקת ראיות גנטיות סיבתיות במעגלים עצביים לאחר הלידה, לפני סריקת תרכובות.
- ביולוגיה של הגילוי: בוחנת היפותזות טיפוליות על ידי מחיקת גנים מועמדים באזורי מוח מוגדרים, כדי להעריך השלכות פנוטיפיות על הבשלה של מעגלים עצביים.
- סריקה: מייצרת תכשירים עצביים סטנדרטיים וניתנים לשחזור עם בקרות פנימיות (תאים מסומנים לעומת תאים לא מסומנים) למדידה מהימנה של השפעת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת תוואי דימות ואלקטרופיזיולוגיה כמותיים המאפשרים השוואה סטטיסטית של גנוטיפים ותנאי טיפול.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין מניפולציה גנטית לתוצאות ברמת המעגל, ובכך תומכת בתיקוף פרה-קליני של מודולציה של מטרה בהלימה לסמנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת הובלה ויראלית רב-שימוש הישימה על פני מספר מטרות גנים ואזורי מוח, ובכך מפחיתה פיתוח כפול של מודלים.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות על ידי קישור אובדן גנים לאחר הלידה לפנוטיפים ספציפיים של מעגלים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של הפרעה גנטית באמצעות הובלה ויראלית, ובכך משפר את השחזור במעבדות ובמחקרים שונים.
- ערך אסטרטגי: מאיץ החלטות לגבי המשכיות הפרויקט (go/no-go) על ידי ביסוס מהיר של סיבתיות גנטית בחלונות זמן פוסט-נטאליים הרלוונטיים למחלה.
- השפעה על הפורטפוליו: מפחית סיכונים בקידום מטרות על ידי אספקת ראיות תפקודיות במערכות המדמות עיתוי של התפתחות נוירונלית אנושית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בעכבריו新生 (neonatal), הזרקה סטריאוטקסית ופרוטוקולי בטיחות ביולוגית עבור נגיפים.
- תלוי בגישה לווקטורים רקומיננטיים מטוהרים של AAV או לנטיוירוס ותשתית של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחייב סטנדרטיזציה של הטיטר הנגיפי, נפח ההזרקה ונהלי ההרדמה כדי להבטיח עקביות בין מחקרים.
- התאמה לאזורי מוח שונים או למינים שונים עשויה לדרוש אופטימיזציה של קואורדינטות ההזרקה והטרופיזם של הסרוטיפ הנגיפי.
- מגבלה מעשית: היעילות תלויה ביעילות ה-Cre recombinase ובזמינות של אללים floxed, שעשויים להשתנות בין יעדים שונים.
