התלכדות חלקיקים שיטת זיהוי poliovirus

המטרה הכוללת של הפרוצדורה הבאה היא לזהות במהירות בידודים של נגיף הפוליו באמצעות פרוטוקול פשוט. עבור בדיקה זו, אנו משתמשים בחלקיקי ג'לטין רגישים המצופים במולקולות כימריות המכילות את הדומיין החוץ-תאי של קולטן נגיף הפוליו האנושי המחובר ל-IgG two fc. מכיוון שלחלקיקים אלו יש זיקה אחידה לכל הסרוטיפים של בידודים של נגיף הפוליו, אגלוטינציה של החלקיקים מתרחשת בעת דגירה עם דגימות המכילות כל סוג של נגיף פוליו אנושי.

עם זאת, אם נוכחים נוגדנים המסוגלים לזהות את נגזרת הויראלית הספציפית המבודדת מהדגימה, מתרחב נטרול המונע את השקיעה. באמצעות מערכת ניסויית זו, ניתן לבצע זיהוי מהיר של בידודי פוליוויראלי בתגובה בעלת שלב אחד. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כמו בדיקת נטרול קונבנציונלית, הוא הפשטות של הפרוצדורה והפירוש, במטרה להפחית את העבודה הנדרשת ולהאיץ את קבלת התוצאות. כדי לשחזר את הנוגדנים anti PV one, PV two ו-PV three, הוסיפו 0.5 milliliters של מים לכל בקבוקון.

לאחר מכן, העבירו כל תמיסת נוגדן למבחנות נפרדות המכילות 4.5 מיליליטר של מדיום תחזוקה. חלק מהמנות של נוגדן anti PV מסופקות בצורה רקונוסטיטוטית; עבור מנות אלו של נוגדן anti PV, אין צורך בהוספת מים לשם רקונוסטיטוציה.

בשלב הבא, הכינו תערובות ביחס של אחד לאחד של תמיסות נוגדים משולבות בנפח סופי של 3.6 milliliters במבחנות חדשות ומסומנות. לדוגמה, ערבבו 1.8 milliliters של anti PV one עם 1.8 milliliters של anti PV two. כדי להכין שילוב של anti PV one פלוס PV two, חזרו על פעולה זו עבור כל שילוב זוגי אפשרי, ובנוסף הכינו תמיסה המכילה את כל שלושת סוגי הנוגדים על ידי ערבוב של 1.2 milliliters מכל סרום נוגדים (antiserum).

לאחר הכנת ארבע התערובות, יש להוסיף 720 microliters של FCS לכל תמיסת נוגדן. פעולה זו תסייע להפחית שקיעה (agglutination) לא ספציפית של חלקיקי ג'לטין על ידי הנוגדנים במהלך הבדיקה. ניתן לשמור את מאגרי הנוגדנים בטמפרטורה של minus 20 degrees Celsius עד לשימושם בבדיקת השקיעה.

בבדיקה זו, אנו משתמשים בחלקיקי ג'לטין בליאופיליזציה המצופים בדומיינים התאיים של הקולטן האנושי לווירוס הפוליו ודומיינים של FC מעכבר של IgG2. יש להשתמש במנה אחת של חלקיקים ולא במנות שונות בניסוי אחד, כדי להבטיח עקביות של תמונת השקיעה. לשחזור החלקיקים, יש להוסיף 1.5 milliliters של תמיפת שחזור לכל מבחנה. הקישו בעדינות כדי לערבב היטב.

ניתן לשמור את החלקיקים לאחר השחזור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד שבועיים. ראשית, תכננו את הניסוי בלוחית מיקרוטיטר בעלת 96 בארות. עבור כל דגימה, באר מספר אחת תכיל את הנגיף לבדו.

בבארים שתיים עד חמש יהיו הנגיף בתוספת אחד מארבעת התמיסות המעורבבות של הנוגדים. הקפידו לשמור באר אחת עבור ביקורת שלילית המכילה מצע בלבד, ללא נגיף או נוגדן. לאחר הגדרת הפלטה, הוסיפו 12 µL של תמיסת הנוגדים המתאימה לכל באר משורות שתיים עד חמש, ו-12 µL של מצע גידול.

תווך למעבדה לנגיף בלבד, לבארות בשורה אחת, ולבארת ביקרת השלילה בשורה שש. לאחר מכן, הוסף 12 µL של דגימת נגיף לחמש השורות הראשונות ו-12 µL של תווך גידול לבארת ביקרת השלילה בשורה שש. לאחר שהנוגדנים והנגיף הופצו בבארות, השהה מחדש את חלקיקי הג'לטין המשוחזרים על ידי טפיחות עדינות והוסף מיד 25 µL של חלקיקים לכל בארה בכל הבארות.

חשוב להקפיד שהחלקיקים לא ישקעו לפני העברתם ללוחית, וזאת כדי להבטיח כמות שווה של חלקיקים בכל באר. הנח את לוחית הבדיקה על מערבל ללוחיות וערבב למשך 30 שניות. לאחר מכן, הנח את הלוחית על דף נייר לבן והדגרה אותה בטמפרטורת החדר למשך שעתיים כדי לאפשר להתרחש שקיעה (agglutination).

חשוב לא להזיז את הפלטה בשום שלב במהלך או לאחר האינקובציה, כיוון שהאגלוטינציה שנוצרה אינה יציבה. ברגע שהתגובה הסתיימה, צלם מספר תמונות של הפלטה שבהן ניתן להתרשם מאיכות האגלוטינציה בכל באר. בבאריים שבהם לא התרחשה אגלוטינציה, כפי שמוצג כאן משמאל, חלקיקי ג'לטין צבעוניים ישקעו בתחתית הבאר, ובבאריים שבהם התרחשה אגלוטינציה.

בשל האינטראקציה בין הווירוס לבין חלקיקי ג'לטין מצופים ב-pvr ו-IgG two A, נראה תבנית צבעים מפוזרת כפי שמוצג במרכז. בניסוי זה, בדקנו את יכולתם של תמיסות וירוס, PV one, two ו-three, להשרות glu בנוכחות הנוגדן. בשילובים המצוינים כאן, בהיעדר וירוס או נוגדנים, לא מתרחשת אגלוטינציה וחלקיקי הג'לטין שוקעים, בניגוד לבאר המכילה וירוס אך ללא נוגדנים.

התרחשה אגלוטינציה כתוצאה מאינטראקציה של הווירוס. עם חלקיקי ג'לטין מצופים ב-PVR IgG בבארות הניסוי, אגלוטינציה של הווירוסים נמנעת בכל באר המכילה נוגדנים המנטרלים באופן ספציפי את אותו וירוס. לדוגמה, אגלוטינציה של poliovirus type one נמנעת בבארות המכילות נוגדני anti PV one, אך לא בבארות המכילות רק נוגדני anti PV two ו-anti PV three.

הדבר נכון גם לגבי סוגי פוליווירוס שני ושלוש. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בתוך שלוש שעות בלבד, אם היא מבוצעת כראוי.