ReAsH / פלאש סימון ניתוח מקדימה של חלבונים בתאים חיישן Tetracysteine

המטרה הכללית של הליך זה היא לסמן תאים המבטאים חלבון עם תג פלואורסצנטי וטטרה-ציסטאין באמצעות הצבעים flash או ash, ולנתח את התוצאות באופן כמותי. דבר זה מושג תחילה על ידי טרנספקציה של פלסמיד הנושא חלבון פלואורסצנטי ואת חלבון המטרה המכיל תג טטרה-ציסטאין אל קו התאים הרלוונטי. לאחר מכן, החלבון המבטא מסומן באמצעות R או flash, והצבע שנקשר באופן לא ספציפי מוסר על ידי שטיפה עם BAL כדי להכין את הדגימה לדימות מיקרוסקופי.

לאחר מכן, משתמשים במיקרוסקופ קונפוקאלי כדי לאסוף תמונות פלואורסצנטיות של התאים בערוצי ash או flash ובערוץ החלבון הפלואורסצנטי. לבסוף, התמונות מנותחות באמצעות Image J כדי לכמת את הקישור של ash או flash לחלבון המטרה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את מידת הקישור של ash או flash לחלבון המטרה בתאים, באמצעות קורלציה בין הפלואורסצנציה של ash לבין הפלואורסצנציה של החלבון הפלואורסצנטי.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון תיוג פשוט של חלבון המטרה ב-GFP, הוא היכולת לעקוב אחר תכונה שנייה של החלבון, כגון שינוי קונפורמציוני, בנוסף למיקומו. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום מבנה התת-יחידה ותפקוד החלבון, כגון אירועי ארגון, שינויים קונפורמציוניים ואירועי קישור של LI המשנים את יכולתו של ה-TAC לבצע flash או ban ash. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר ביקשנו להעריך כיצד נוצרים בתאים פוליגונים סוב-מיקרוסקופיים קטנים של met Huntington.

הדגמה ויזואלית של שיטה זו היא קריטית, שכן שלבי ניתוח הנתונים קשים ללמידה בשל מורכבותם הטכנית. הדגמה של הפרוצדורות הניסיוניות. את שלבים אחת עד שלוש תבצע Yasmin Ranson, עוזרת מחקר מהמעבדה שלנו, שתדגים את ניתוח הנתונים. שלב ארבע יבוצע על ידי Sevki GaN, סטודנט לתואר מתקדם מהמעבדה שלנו, תוך שימוש בשיטות סטנדרטיות לתרבית תאים עבור קו התאים הרלוונטי ושקופית לדימוי תאים חיים המוכנה לטרנספקציה.

הכינו תרבית של תאי היצמדות והעבירו טרנספקציה של הפלסמיד שלכם המכיל את הגן של עניין עם תג TC. בהתאם לשיטת הטרנספקציה הנבחרת, חשוב להשתמש בביקורות חיוביות ושליליות כדי להעריך את מידת הקישור הספציפי לתגי ה-TC, וכן כדי להעריך זליגת פלואורסצנציה בין הערוצים בעת איסוף מיקרוגרפים קונפוקאליים. לכן, עבור שני צבעים, ודאו שהדגימות מוכנות לצבעים בודדים, בין אם מדובר בחלבון הפלואורסצנטי לבדו ואם אפשרי, בחלבון T ctech הקשור ל-flesh או להיפוכו.

אבל ללא חלבון פלואורסצנטי. יום עד יומיים לאחר הטרנספקציה, שטפו בעדינות את התאים עם 300 µL של תמיסת מלחים מאוזנת של הנקס (Hank's balanced salt solution) או HBSS שחוממה מראש, הכינו HBSS טרי שחומם מראש עם 10 µM של 1,2-ethanedithiol או EDT ו-1 µM של flash או ash. לאחר הסרת ה-HBSS מהתאים, החליפו אותו בעדינות ב-300 µL של מצע ash והדגירו למשך 30 דקות בדיוק בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לתרביות רקמה.

מניסיוננו, זמני דגירה ממושכים מגבירים באופן משמעותי את הפלואורסצנציית הרקע. שאבו בעדינות את תמיסת הסימון מהתאים והחליפו אותה ב-300 µL של HBSS שחומם מראש עם 250 µM של two three dimer, cap propanol, או BAL למשך 15 דקות ב-37 °C. הסירו את תמיסת השטיפה באמצעות שאיבה עדינה והחליפו אותה ב-300 µL של HBSS שחומם מראש.

לאחר שטיפה זו, ניתן לקבע את התאים באמצעות פאראפורמלהיד, אם כי מצאנו כי הדבר מגביר פלואורסצנציה לא ספציפית. לכן, בדרך כלל אנו מדמייים את התאים כשהם חיים בטמפרטורת החדר. בנוסף, קיבוע תאים לפני סימון מונע את קשירת הצבע.

כדי להתחיל בדימות תאים במיקרוסקופ קונפוקלי, הגדירו את הפרמטרים לדימות הפלואורופורים הבודדים וודאו כי רמת הדילול (bleed through) בין הערוצים זניחה. לאחר מכן, כווננו את הגדרות המכפיל הפוטואלקטרי (photo multiplier) כך שהפלואורסצנציה המקסימלית בדגימה לא תגרום לרוויה של הגלאי. ברגע שנקבעו הגדרות הדימות המיטביות, אין לשנות אף אחת מהן בין הדגימות.

השתמשו בקצב סריקה של 200 hertz, אספו ארבעה ממוצעי קווים, והגדירו את קוטר הפינהול (pinhole) ליחידה אחת של שטח. ניתן להגדיל את קוטר הפינהול אם קיים קושי ביחס אות-רעש. עם זאת, הדבר עלול להוביל לאובדן מסוים ברזולוציית הדימוי.

יש לאסוף את תמונות הקונפוקלי בפורמט של 12 ביט או גבוה יותר, במידת האפשר, כדי למקסם את איכות הניתוח של הנתונים הכמותיים. יש לאסוף תמונות עבור הערוץ של החלבון הפלואורסצנטי וכן עבור הערוץ של צבע ה-BI arsenal עבור כל הדגימות.

לניתוח הנתונים, השתמש בתוכנת Image J עם התוספים הבאים. אם אתה משתמש בגרסה של Image J ישנה מגרסה 1.32 C, לחץ על האפשרויות הבאות. כדי לאפשר פתיחה של מספר תמונות בו-זמנית, ערוך את האפשרויות input slash output, ולחץ על התיבה use j file chooser to open slash share.

לחצו על אישור. פתחו את התמונות הרלוונטיות. Image J יגדיר באופן אוטומטי את עוצמות הפיקסלים המקסימלית והמינימלית המוצגות על המסך עבור כל תמונה בנפרד, מכיוון שלתמונות שונות יהיו עוצמות פיקסלים שונות.

משמעות הדבר היא שהתמונות המוצגות אינן ניתנות להשוואה כפי שהן נראות. כדי להבטיח שכל התמונות הפתוחות יהיו באותו קנה מידה, הגדירו פיזית את עוצמות הפיקסלים העליונות והתחתונות שיוצגו. כדי להגדיר ערכים אלו, בחרו בתמונה (image), ולאחר מכן בהתאמת בהירות/ניגודיות (adjust brightness/contrast).

לחצו על set, הגדירו את ערכי התצוגה המינימליים והמקסימליים. לאחר מכן בחרו ב-propagate to all open images ולחצו על okay. לחלופין, ניתן לרכז את כל התמונות של ערוץ מסוים לקובץ אחד או למחסנית (stack).

לאחר מכן, Image J יתאים אוטומטית את כל התמונות לאותו קנה מידה. כדי לעשות זאת, בחרו ב-image stacks, ואז ב-images to stack, הזינו שם המשותף לכל קובץ ובחרו ב-used titles as labels. לחצו על okay.

המיר את כל התמונות הפתוחות לשמונה ביט לצורך אנליזה. בחירה בסוג תמונה של שמונה ביט תבצע שינוי קנה מידה (rescale) של הטווח הנצפה למרווח שבין 0 ל-255. חשוב לא לשמור את התמונות על פני הפורמט המקורי של 12 ביט ומעלה, שכן הדבר יוביל לאובדן של תוכן מידע.

שמרו עותק בתיקייה חדשה בשם eight bit converted באמצעות אפשרות "שמירה בשם" (save as). שיטה אחת לבחינת מידת הקישור של צבע הבי-ארסול (bi arsal die) בתמונה שלמה היא ביצוע תרשים מתאם של עוצמת פיקסלים. תרשים זה מציג כל ערך פיקסל בערוץ אחד ביחס לערך הפיקסל התואם בערוץ שני.

לפיכך, מיקום פיקסל בעל פלואורסצנציית GFP גבוהה יהיה בעל פלואורסצנציית ash גבוהה גם כן, במידה וקיימת קישוריות גבוהה. כדי לנתח את המתאם בין הפיקסלים, ודאו שתמונות ה-REA וה-GFP בפורמט שמונה ביט פתוחות ב-ImageJ. לאחר מכן, פתחו את התוסף image correlator על ידי בחירה ב-Plugins ואז ב-Image Correlator. שייכו את קבצי התמונה לתמונה אחת (Image One) ולתמונה שתיים (Image Two).

לאחר מכן לחצו על אישור. ייתכן שערימה זו לא תציג מידע מפורט. זהו מצב תקין.

שמרו את הערימה בתיקייה חדשה בשם scatterplots ותנו לה את אותו שם קובץ של הדגימה שאליה היא מתייחסת. לדוגמה, Ash GFP Correlation plot. כדי לצפות בנתונים, בחרו אחת משתי האפשרויות.

ראשית, המירו את הנתונים לפורמט לוגריתמי על ידי בחירה ב-process math log auto. לאחר מכן, כדי לשנות את קנה המידה הוויזואלי של הנתונים, לחצו על image adjust brightness slash contrast ובחרו ב-auto. שנית, שנו את קנה המידה הוויזואלי של הנתונים כך שיוצגו רק ערכים נמוכים, והציגו את הנתונים באמצעות טבלת חיפוש מיוחדת או LUT כדי ליצור LUT מותאם אישית.

לחצו על עריכת צבע תמונה LUT עבור LUT פשוט מאוד. לחצו על הפיקסל השמאלי העליון ובחרו בצבע שחור. לאחר מכן בחרו בפיקסל הבא מימין ובחרו בצבע אדום.

בשלב הבא, לחצו על הפיקסל השלישי, ובזמן שאתם לוחצים על כפתור העכבר, גררו את הבחירה אל הפיקסל הימני התחתון. בחרו בצבע אדום, לחצו על אישור, ולאחר מכן בחרו בצבע לבן ולחצו על אישור. בחרו בטווח הבהירות/ניגודיות (brightness/contrast) מאפס עד 255 כפי שהוסבר קודם לכן, כדי לקבע את התמונה כפי שהיא מוצגת על המסך.

המיר את התמונות לפורמט RGB כדי להעתיק ולהדביק אותן לתוכנות אחרות. ראשית, פתח את התמונות ב-8 ביט או ב-16 ביט כפי שתואר קודם לכן. הקצה סכמת צבעי LUT לתמונות עבור GFP.

הקצו את ה-LUT הירוק על ידי לחיצה על התמונה. טבלאות המרה (Look up tables) ירוקות. לבסוף בחרו את התמונה להעתקה והעתיקו אותה ללוח המעתיקים על ידי בחירה ב-edit copy to system. דמות זו מציגה תוצאה טיפוסית עבור ה-kinase sock המחובר ל-GFP ולתג TC שנצבע במשך 30 דקות.

עם ASH בתאי HEC 2 9 3, נראה כי ASH נקשר ביעילות ובזיקה גבוהה לחלבון המטרה הנושא תג TC. לעומת זאת, דמות זו מציגה את דגימת הביקורת התואמת של SARK המהושר ל-GFP, אך ללא תג ה-TC, דבר החיוני לאימות both הספציפיות של תג ה-TC ורמת הצביעה של הרקע. תוצאה זו מראה כי ל-RH אין תגובה עם חלבון המטרה שחסר את תג ה-TC, מה שמעיד על הספציפיות של תג ה-TC לקשירת SSH.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לא לאפשר לתאים להגיע למצב של התמזגות (confluence) ושקט, שכן הדבר ישפיע על קישור ה-V בתאים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לנתח את הנתונים שלכם באופן כמותי בצורה פשוטה, ותוכלו לדייק שיטות אלו כדי לפתח IUTS ייחודיים משלכם לוויזואליזציה של נתונים.